1概念

細(xì)胞工程（Cell engineering）：

是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法，按照人們的需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上的遺傳操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。

細(xì)胞工程與基因工程一起代表著生物技術(shù)新的發(fā)展前沿，伴隨著試管植物、試管動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等相繼問世，細(xì)胞工程在生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

21世紀(jì)合成生物學(xué)的發(fā)展，采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、DNA或基因合成技術(shù)，人工設(shè)計(jì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，乃至整個(gè)基因組與細(xì)胞的人工設(shè)計(jì)與合成，從而刷新了基因工程與細(xì)胞工程技術(shù)，并將帶來生物計(jì)算機(jī)、細(xì)胞制藥廠、生物煉制石油等技術(shù)與產(chǎn)業(yè)革命。

2特點(diǎn)

1．前沿性：現(xiàn)代生物技術(shù)的熱點(diǎn)

2．爭(zhēng)議性：新技術(shù)給倫理道德帶來的沖擊

3．綜合性：多學(xué)科交叉

4．應(yīng)用性：工程類課程，重在產(chǎn)品與技術(shù)

3研究?jī)?nèi)容

動(dòng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)

細(xì)胞融合（新的物種或品系、單克隆抗體）

細(xì)胞核移植（無性繁殖、克隆動(dòng)物）

染色體工程（多倍體育種，例：八倍體小黑麥）

胚胎工程（優(yōu)良品種、試管嬰兒）

干細(xì)胞與組織工程（胚胎干細(xì)胞、組織干細(xì)胞）

轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物）

4核心技術(shù)

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核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖

目的：獲得新性狀、新個(gè)體、新物質(zhì)或產(chǎn)品

5發(fā)展簡(jiǎn)史

細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

1665年，英國人胡克（Hooke）利用自己設(shè)計(jì)的顯微鏡次觀察到了細(xì)胞。

細(xì)胞理論的提出

1838年，施萊登（Schleiden）發(fā)表“植物發(fā)生論”，認(rèn)為無論怎樣復(fù)雜的植物都由細(xì)胞構(gòu)成。

1839年，施旺（Schwann）發(fā)表 “關(guān)于動(dòng)植物結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)一致性的顯微研究”。提出“細(xì)胞學(xué)說”（Cell Theory）。之后，德國科學(xué)家魏爾肖（Virchow）補(bǔ)充了細(xì)胞學(xué)說，認(rèn)為所有的細(xì)胞都來自于已有的細(xì)胞分裂。細(xì)胞學(xué)說的建立揭示了生物界的統(tǒng)一性和生命的共同起源，是19世紀(jì)自然科學(xué)的三大發(fā)現(xiàn)之一。

細(xì)胞與組織培養(yǎng)

1902， Haberlandt，植物細(xì)胞學(xué)說。

1907， Harrison，蛙胚神經(jīng)細(xì)胞突起，無菌操作技術(shù)。

1912， Carrel，雞胚心肌組織塊長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。

1940， Earle， *單個(gè)細(xì)胞克隆培養(yǎng)，建立小鼠結(jié)締組織

L細(xì)胞系，并在1951年開發(fā)了人工培養(yǎng)液。

細(xì)胞融合

1975，Cesar Milstein與Geoger Kohler合作，羊紅細(xì)胞免疫過的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，得到既能體外無限繁殖又能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。

胚胎工程

1978年，英國劍橋大學(xué)生理學(xué)家羅伯特·愛德華采用胚胎工程技術(shù)成功培育出世界*試管嬰兒-路易絲-布朗。

轉(zhuǎn)基因生物

1983年P(guān)almiter和Brins ter將大鼠生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入小鼠，生產(chǎn)出生長(zhǎng)速度極快的碩鼠。

1987年Gordon獲得分泌組織纖溶酶原激活因子tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。

細(xì)胞核移植

1938年，德國胚胎學(xué)家Spemann提出胚胎細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中可發(fā)育為新胚胎。[1]

1997年， “多莉”羊的誕生標(biāo)志著哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞核克隆時(shí)代到來。

6種類

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動(dòng)物細(xì)胞的染色體工程

又稱為染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)，或染色體介導(dǎo)的基因的轉(zhuǎn)移。染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)術(shù)，目前有兩類，其一，稱為微細(xì)胞轉(zhuǎn)移術(shù)。應(yīng)用低濃度秋水仙素長(zhǎng)時(shí)間處理可使細(xì)胞微核化，經(jīng)去核處理后，可得到只含相當(dāng)于幾個(gè)乃至一個(gè)染色體的微細(xì)胞。微細(xì)胞被導(dǎo)入完整細(xì)胞以后仍顯示RNA合成，因而微核編碼的基因信息可望在微細(xì)胞異核體內(nèi)表達(dá)出來。如小鼠的微細(xì)胞可被導(dǎo)入至另一品系的小鼠或倉鼠乃至人的HeLa細(xì)胞內(nèi)。電泳檢測(cè)顯示存在著小鼠基因型的大分子物質(zhì)，如脂酶D、嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶B。已知前兩種酶的結(jié)構(gòu)基因定位于小鼠的第14號(hào)染色體上。提示小鼠的該號(hào)染色體已進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)并行使其功能。

另一種方法是先誘發(fā)細(xì)胞同步分裂，繼用秋水仙素阻抑細(xì)胞分裂于中期，再破碎細(xì)胞，通過離心收集大量的中期染色體。有人把此法得到的人或倉鼠的中期染色體轉(zhuǎn)移到小鼠細(xì)胞內(nèi)，并探查到有特異的供體基因的功能產(chǎn)物，動(dòng)物的染色體工程與育種

如胸苷激酶（TK）與次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）。并推測(cè)整合到宿主小鼠內(nèi)攜帶TK基因的染色體片段約大于 17000個(gè)堿基。有人證明通過染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，不僅在宿主細(xì)胞的分裂過程中能穩(wěn)定地傳給子代，而且還能進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，如人染色體基因可以轉(zhuǎn)移到小鼠細(xì)胞內(nèi)，然后再使用同樣的技術(shù)從小鼠細(xì)胞轉(zhuǎn)移到中國倉鼠細(xì)胞內(nèi)。這些實(shí)驗(yàn)是在染色體水平上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的良好開端。

植物細(xì)胞的染色體工程

在高等植物方面的染色體工程，目前還僅在六倍體普通小麥與其他種、屬之間做過。六倍體普通小麥的染色體組型是由野生一粒小麥AA、小斯卑特山羊草BB和匯山羊草DD三種類型的染色體組融合而成，是一種能正常繁殖的種間雜種（AABBDD），因此，很容易容納其他種、屬染色體添加或替代。這個(gè)領(lǐng)域的研究目的在于改良作物品種和探究物種起源。

1.染色體的消除①單體植物，起初是利用自然發(fā)生的單倍體普通小麥制作?，F(xiàn)在則用人工誘導(dǎo)花粉或未受精的子房產(chǎn)生的單倍體植株為材料進(jìn)行。這是因?yàn)槠胀ㄐ←湹膯伪扼w植株只有21條染色體，都不是成對(duì)的，因此在成熟分裂（見減數(shù)分裂）時(shí)沒有聯(lián)會(huì)的對(duì)象，故仍為單價(jià)染色體。這21個(gè)單價(jià)染色體能排列在赤道板上縱裂為二，在后期Ⅰ被平均分配到細(xì)胞的兩極。但在第二次分裂時(shí)，這21個(gè)染色體不再縱裂，隨機(jī)分開，結(jié)果產(chǎn)生了染色體數(shù)從0～21個(gè)的 21種類型的配子。

這些配子只有具19條或20條染色體的有受精能力。因此，如果用正常植株的花植物的染色體工程與育種

粉（n=21）給單倍體植株授粉，n=20的卵細(xì)胞以一定的比例受精，結(jié)果得到2n=41的植株。其染色體組型中有20條染色體因有同源（對(duì)應(yīng)）染色體故可以配對(duì)形成二價(jià)染色體。而只有一條染色體沒有配對(duì)，成為單價(jià)染色體，因此稱這種類型的植物叫單體植物。例如，美國米蘇里大學(xué)的E.R.西爾斯于1937～1954年共用了十七年的時(shí)間，用中國春小麥中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)單倍體植物與正常花粉授粉，得到的后代中找到了 5種單體植物。其后用同樣方法制作一套21種單體植物。除普通小麥外，煙草和硬粒小麥也制成了一套單體植物。②缺對(duì)植物，單體植物的體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=41。在成熟分裂后，將形成兩種配子，即n=21，n=20，這兩種雌雄配子都有受精能力，而且自花授粉后也容易結(jié)實(shí)。不過兩者受精率的高低有差別。因此，受精時(shí)，兩種配子按一定比例進(jìn)行結(jié)合。結(jié)果見表1。如果缺失型的花粉與缺失型的卵細(xì)胞結(jié)合為受精卵,由此發(fā)育成的植物，將比通常的普通小麥少一對(duì)染色體，所以叫缺對(duì)植物。E.R.西爾斯用此方法也培育出了一套普通小麥缺對(duì)植物。

2.染色體的添加①同種染色體的添加，所添加的染色體來自同種個(gè)體，添加一個(gè)的叫三體植物（2n+1）；添加一對(duì)的叫四體植物（2n+2）。三體植物和單體植物一樣，可得自單倍體三倍體或缺體。它的來源很多。如普通小麥單體植物在成熟分裂時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不分離現(xiàn)象（即單價(jià)染色體的二個(gè)姊妹染色單體在后期Ⅰ被同時(shí)拉到同一極，而不是各自分配到兩極）。結(jié)果所形成的四分孢子，其中三個(gè)的染色體數(shù)是n=20，一個(gè)是n=22。如果多一個(gè)染色體的配子與正?；ǚ刍蚵鸭?xì)胞（n=21）受精后，就成為三體植物（2n=43）,比原來正常普通小麥多了一個(gè)染色體。三體植物自花授粉的后代中就有四體植物出現(xiàn)。因?yàn)槿w植物在成熟分裂時(shí)形成兩種配子（n=21,n=22）。如果讓三體植物自花授粉，就會(huì)出現(xiàn)三種類型的子代，如表2所示。其中就有新型的四體植物，比正常植物多兩條染色體。②異種染色體的添加，所添加的染色體來自別種植物。以普通小麥（W）和黑麥（R）2n=14雜交為例（圖1）。由于黑麥染色體不能和普通小麥配對(duì)，在成熟分裂染色體重組時(shí)，黑麥基因不能直接轉(zhuǎn)移到小麥染色體上，而只能將黑麥整個(gè)染色體組加到小麥的染色體組中，所得子一代雜種為多倍單倍體（21′W7′R）,僅28個(gè)染色體。經(jīng)過秋水仙素處理加倍后，成為小黑麥八倍體（21″W7″R）共有56個(gè)染色體，再與小麥回交得到七倍體（21″W7′R）,共49個(gè)染色體。然后與小麥再回交一次，就可得到外加的單體植物。單體植物自交后得二體植物（44個(gè)染色體21″W1″R）。另外，還有一個(gè)外加系是加入了黑麥第Ⅱ?qū)θ旧w，成為44個(gè)染色體的二體植物。這種外加系能使小麥抗銹（見染色體倍性）。

3.染色體的替代用同種或異種染色體來替代某特定染色體的技術(shù)。其目的是要把已知道的具有抗病或其他有利特性的某一染色體來替代另一個(gè)具有其他性狀的染色體，以改良作物品種。染色體替代有三種方法：①用普通小麥自身的染色體來替代。例如，普通小麥的一對(duì)1A染色體被一對(duì)1B染色體替代后，就能育成缺對(duì)1A、四體 1B植物，即缺對(duì)-四體植物。這種類型的植物是由缺對(duì)1A與四體1B雜交后所得子一代再自花授粉后選育而成。②普通小麥的一個(gè)品種的染色體用別的品種的染色體來替代，叫做同種染色體替代。如果用正常普通小麥B品種的花粉，與缺對(duì)的A品種雜交，所得子一代自花授粉，則在子二代就能選育出A品種的缺對(duì)的二條染色體被B品種染色體替代的植物。③用異種植物的染色體來替代，叫異種染色體替代。例如，普通小麥的2A染色體可用黑麥的2R染色體替代。為了達(dá)到這個(gè)目的，首先要育成基本材料缺對(duì)植物（2n=42-2A）和異種染色體外加系（2n=42+2R）。這樣就可把普通小麥缺對(duì)2A與小麥2R染色體外加系（具有21對(duì)小麥染色體加上一對(duì)黑麥2R染色體）雜交，子一代雜種染色體2n=42，其中20對(duì)染色體是除2A外的全部普通小麥染色體，其余二個(gè)一價(jià)染色體是2A和2R，成熟分裂時(shí)可產(chǎn)生四種類型配子，即：n=20+2A+2R,n=20+0,n=20+2A=21，n=20+2R=21。這后一種是具有除2A以外的20個(gè)普通小麥染色體一個(gè)黑麥的2R染色體。因此，子一代雜種自花授粉的后代中，就能得到所期望的異種染色體替代植物。即一對(duì)黑麥的2R替代了一對(duì)小麥的2A（20″W2″R）。

現(xiàn)在，應(yīng)用染色體工程的方法，在許多添加和替代染色體工作中，已經(jīng)獲得了不少有遺傳學(xué)和育種學(xué)價(jià)值的品系。例如，獲得了添加單個(gè)冰草染色體的小麥品系中間，有的能抗粉露菌病、稈銹和葉銹。這種抗性均呈現(xiàn)顯性單因子遺傳。將黑麥第Ⅲ對(duì)染色體加到軟粒小麥對(duì)粉露菌病有抗性。用冰草的一個(gè)染色體替代軟粒小麥染色體3D，使軟粒小麥對(duì)稈銹有抗性。這些在生產(chǎn)實(shí)踐上都有實(shí)用價(jià)值。

染色體組工程

誘導(dǎo)增加或減少一個(gè)生物體內(nèi)整套染色體組數(shù)的技術(shù)。增加同種染色體組數(shù)的叫同源多倍體；增加異種染色體組數(shù)的叫異源多倍體，異源多倍體必須經(jīng)過雜交才能得到（圖2）（見染色體倍性）。

染色體組工程的方法:多倍體的誘發(fā)　自1937年發(fā)現(xiàn)了用秋水仙素誘發(fā)多倍體的方法以來，一般常用藥劑（秋水仙素、富民隆等），也可用高溫處理來誘發(fā)多倍體。其法是把植物的種子或幼芽浸在 0.05～0.2%的秋水仙素水溶液中，處理24～96小時(shí)即可得到很好的效果。例如四倍體西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法獲得的（圖2）。

現(xiàn)在，由于原生質(zhì)體分離技術(shù)的發(fā)展，也可從原生質(zhì)體的融合得到多倍體。例如用聚乙二醇作誘導(dǎo)融合劑處理胡蘿卜原生質(zhì)體后，得到了頻率相當(dāng)高的四倍體和六倍體植株。這是來源于二個(gè)或三個(gè)原生質(zhì)體融合的結(jié)果。

單倍體的誘發(fā)　60年代以來，子房、花藥或花粉離體培養(yǎng)成功，很易從大孢子、卵細(xì)胞或小孢子等得到單倍體植株。其法是將一定時(shí)期的花藥或子房移植到特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待生長(zhǎng)愈傷組織或胚狀體后，再移到分化培養(yǎng)基上，分化出苗和根，長(zhǎng)成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中繼續(xù)栽培到開花。單倍體植物一般不能結(jié)實(shí)或僅結(jié)少量種子。

此外，還可用遠(yuǎn)緣雜交，X射線或紫外線照射，化學(xué)藥品如馬來酰肼、甲苯胺藍(lán)、氯霉素等以及異源胞質(zhì)等方法都能誘導(dǎo)單倍體產(chǎn)生。1970年有人又用大麥與球莖大麥雜交后染色體消除的方法，產(chǎn)生高頻率的單倍體，有的可高達(dá)68.5%。在雜交后，球莖大麥的7個(gè)染色體就消除在胚中，留下的是大麥的7個(gè)染色體，成為單倍體的胚及小植株。經(jīng)秋水仙素處理后，染色體加倍形成純合二倍體。

染色體組工程的應(yīng)用誘導(dǎo)多倍體在植物育種上的應(yīng)用是有限度的。由于作物類型不同，對(duì)多倍性誘變反應(yīng)也不同。原來的倍性水平、染色體組的結(jié)構(gòu)、繁殖方式、多年生性、植株實(shí)用部位，所有這些都關(guān)系到育種的成敗。適宜用染色體加倍方法改良的作物應(yīng)該具有：①染色體數(shù)目較少，②以收獲營養(yǎng)體為主，③異花授粉，④多年生和營養(yǎng)繁殖的習(xí)性等條件。這些都是多倍體育種獲得成功的先決條件。

細(xì)胞質(zhì)工程

研究真核細(xì)胞的核、質(zhì)相互關(guān)系以及細(xì)胞器，胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移等細(xì)胞拆合的技術(shù)，所以又叫細(xì)胞拆合工程。主要研究?jī)?nèi)容是細(xì)胞質(zhì)的置換。過去在植物上置換的方法是進(jìn)行連續(xù)回交。例如，為了研究柳葉菜屬的細(xì)胞質(zhì)遺傳，曾連續(xù)回交了二十五代，結(jié)果還不能把全部母核替代出來?，F(xiàn)在由于核移植和原生質(zhì)體的分離方法的改進(jìn)，推進(jìn)了這項(xiàng)工程的進(jìn)展。

細(xì)胞質(zhì)工程的方法去核和核移植　動(dòng)物細(xì)胞核的移植一般都用顯微操作器進(jìn)行。50年代初期，美國生物學(xué)家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的蛙卵，并能正常發(fā)育。后來，英國J.B.格登把爪蟾蝌蚪腸上皮細(xì)胞核移植到去核卵內(nèi)，能發(fā)育到有生殖能力的成體。中國童第周等還成功地進(jìn)行金魚類異種、異屬之間的核移植實(shí)驗(yàn)（見細(xì)胞分化）。70年代以來，體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的去核，是先用細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞，再高速離心使細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分開。分離出來的核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為“核體”或“小型細(xì)胞”。核體能重新再生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長(zhǎng)、分裂。去核后的胞質(zhì)部分，仍由膜所包圍，即為“胞質(zhì)體”或“去核細(xì)胞”（圖3）。秋水仙素及其衍生物和長(zhǎng)春新堿等也能誘發(fā)某些哺乳類細(xì)胞排核。目前制備胞質(zhì)體和核體的方法目臻完善，純度可達(dá)99%左右。胞質(zhì)體約可存活18～36小時(shí)。

植物細(xì)胞核的移植，在低等植物如單細(xì)胞傘藻，可把新鮮材料的假根切下，放在玻片上用玻棒擠壓，使細(xì)胞的內(nèi)含物壓出在一滴適合的培養(yǎng)液中，反復(fù)沖洗幾次，然后在顯微鏡下觀察，一直到核周圍無細(xì)胞質(zhì)為止。離心分離后待用。高等植物如矮牽牛、天仙子、煙草、番茄等原生質(zhì)體核的分離，可先在懸浮的原生質(zhì)體中用蒸餾水將懸液沖淡一半，約30分鐘后，原生質(zhì)體破裂，放出細(xì)胞核與葉綠體，就可在0.6M蔗糖液中離心和收集核，然后存放在一定的培養(yǎng)液中待用。1978年以來又借用動(dòng)物細(xì)胞去核的藥劑細(xì)胞松弛素B來處理原生質(zhì)體，加上高速離心，使原生質(zhì)體分離成二部分，即：無核原生質(zhì)體和小原生質(zhì)體。開辟了去植物細(xì)胞核甚至去部分染色體的新途徑。

細(xì)胞重組已經(jīng)分離的核體（小細(xì)胞）與胞質(zhì)體在融合因子的介導(dǎo)下重新融合，構(gòu)成“重組細(xì)胞”，這一技術(shù)即稱為細(xì)胞重組，胞質(zhì)體與另一完整細(xì)胞融合，即產(chǎn)生“胞質(zhì)雜種”細(xì)胞。這兩種細(xì)胞產(chǎn)生的效果是不同的，現(xiàn)在有方法把它們鑒別開。以大鼠二種成肌細(xì)胞為材料，一種是正常的具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT+）基因，另一種是突變體缺少這種基因（HGPRT-），因此，前者細(xì)胞中有轉(zhuǎn)移酶能被氚-次黃嘌呤標(biāo)記，而后者沒有這種酶，便不能標(biāo)記。在兩者的細(xì)胞質(zhì)中讓HGPRT+攝取小乳膠顆粒，讓HGPRT-攝取大乳膠顆粒，以顆粒的大小來作標(biāo)記。當(dāng)核體（小型細(xì)胞）與胞質(zhì)體融合后，在重組細(xì)胞中可看到核被氚-次黃嘌呤所標(biāo)記，在細(xì)胞質(zhì)中有大量大乳膠顆粒和極少數(shù)小乳膠顆粒。當(dāng)胞質(zhì)體與另一個(gè)HGPRT+完整細(xì)胞融合后的胞質(zhì)雜種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，則同時(shí)出現(xiàn)有大量的大、小乳膠顆粒。如圖4所示。應(yīng)用這種方法很容易把兩類細(xì)胞鑒別出來。

在植物中，原生質(zhì)體與核的融合以煙草、矮牽牛的核移植為例，其步驟是：①先使矮牽牛游離核與煙草原生質(zhì)體各自懸浮并沉淀在0.25M硝酸鈣溶液中，pH6；②去掉上清液，再把它們懸浮起來，以適當(dāng)比例使核與原生質(zhì)體在試管中混合、離心，隨后加入45%聚乙二醇溶液1毫升使之聚合：③30分鐘后，徐徐加入4毫升0.2M硝酸鈣（被pH9的甘氨酸氫氧化鈉所緩沖）以誘導(dǎo)融合攝取核；④15分鐘后加0.2M硝酸鈣（pH6）;⑤再過20分鐘，原生質(zhì)體用培養(yǎng)液沖洗；⑥鏡檢后，將具有雙核的（其中一個(gè)是矮牽牛的核）煙草原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞質(zhì)工程的應(yīng)用動(dòng)物方面1974年有人用兩種小鼠成纖維細(xì)胞，其一用L細(xì)胞的完整細(xì)胞，它的核內(nèi)具有對(duì)5-溴脫氧尿苷抗性的核基因BUd（RR）,但細(xì)胞質(zhì)內(nèi)沒有抗氯霉素的胞質(zhì)基因，用的另一個(gè)細(xì)胞的線粒體上帶有抗氯霉素的胞質(zhì)基因CA（PR），而細(xì)胞核內(nèi)帶有硫代鳥嘌呤敏感核基因（TGS）,把后者去核細(xì)胞與前者融合（圖5），則融合后的胞質(zhì)雜種細(xì)胞既能抗5-溴脫氧尿苷（BUdR），又能抗氯霉素（CAP）。但如果把親體細(xì)胞（BUdRR和TGS）同時(shí)培養(yǎng)在含有這兩種藥物的培養(yǎng)基上，則都將死去。因?yàn)檫@兩種細(xì)胞一個(gè)對(duì)CAP敏感，另一個(gè)不抗BUdR,而胞質(zhì)雜種細(xì)胞則兩者都能抗，不但能存活而且還能增殖。

植物方面用等滲密度梯度高速離心后，也可得到兩種亞原生質(zhì)體，①在低密度范圍內(nèi)可得到胞質(zhì)體（去核原生質(zhì)體）；②在高密度中，可得到小原生質(zhì)體（核質(zhì)體）?，F(xiàn)在已能自玉米、煙草和胡蘿卜細(xì)胞得到這兩種亞原生質(zhì)體。生化實(shí)驗(yàn)證明：去核原生質(zhì)體代謝作用很低，而小原生質(zhì)體由于減少了表面積和體積（僅及原生質(zhì)體的10～15%），因此，攝取物質(zhì)快，合成蛋白質(zhì)也快，培養(yǎng)時(shí)發(fā)育迅速，是一種研究核質(zhì)關(guān)系的好材料。由于這項(xiàng)工作才開始，迄今尚無明顯結(jié)果。

細(xì)胞融合工程

細(xì)胞融合是指用自然或人工的方法，使兩個(gè)或幾個(gè)不同的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過程。細(xì)胞融合的結(jié)果，一個(gè)細(xì)胞中含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核，則稱為異核體；隨后的有絲分裂中，來自不同細(xì)胞核的染色體可能合并到一個(gè)結(jié)合核內(nèi)。因此，又稱為體細(xì)胞雜交。細(xì)胞融合的范圍很廣，從種內(nèi)、種間、屬間、科間一直到動(dòng)、植物兩界之間都進(jìn)行了嘗試。在植物方面，由于各類細(xì)胞具有性，在煙草、矮牽牛、胡蘿卜等種間雜種，馬鈴薯和番茄、曼陀羅和顛茄、煙草和矮牽牛等屬間雜種都已獲得了再生植株。在動(dòng)物方面人和鼠體細(xì)胞雜交，雖然不能長(zhǎng)成一個(gè)新個(gè)體，但能作基因定位的材料。因此，這項(xiàng)新技術(shù)，在理論研究和工、農(nóng)、醫(yī)方面的應(yīng)用，均有廣闊的前景。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展，歷史很短。自1960年在體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)雜種細(xì)胞以來，僅20多年。1965年岡田善雄等和H.哈里斯等各自用滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了個(gè)種間異核體。1970年已應(yīng)用人與鼠的細(xì)胞雜交系統(tǒng)地進(jìn)行了人類染色體基因的定位工作。在植物方面，1960年E.C.科金首先使用纖維素酶分離番茄幼根的原生質(zhì)體獲得成功。1970年他們又成功地使種間原生質(zhì)體融合在一起。1972年P(guān).S.卡爾森等又從融合的原生質(zhì)體獲得了株種間細(xì)胞雜種。到1980年為止，種間融合的再生植株已有16種之多。

細(xì)胞融合的方法動(dòng)物細(xì)胞雜交或細(xì)胞融合　將兩個(gè)不同種的親本細(xì)胞A和B，以滅活的仙臺(tái)病毒或聚乙二醇（PEG）為融合誘導(dǎo)劑，使A和B兩細(xì)胞融合成為一個(gè)具兩個(gè)遺傳性不同核的異核體（如遺傳性相同的核融合在一起叫同核體）。隨后異核體經(jīng)有絲分裂成為兩個(gè)具有A和B兩親本的雜種融合核。AB雜種經(jīng)多次分裂，B親本的染色體會(huì)逐漸減少到一個(gè)或*消失（圖6）。

植物體細(xì)胞雜交①原生質(zhì)體的分離。植物細(xì)胞之間有果膠質(zhì)粘連，每個(gè)細(xì)胞之外還有一層纖維素組成的壁，因此，在分離原生質(zhì)體時(shí)，首先要在一定濃度的酶液（果膠酶與纖維素酶）中保溫，消去果膠質(zhì)與纖維素后才能使原生質(zhì)體分離出來。②原生質(zhì)體的融合。不同種之間原生質(zhì)體的融合，須選用一種融合誘導(dǎo)劑（聚乙二醇，或高鈣CaCl2.2啹O,0.05M溶于甘露醇 0.4M和pH10.5）誘導(dǎo)融合。它們的誘導(dǎo)率可達(dá)20～50%。③雜種細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)。細(xì)胞融合后要把雜種細(xì)胞選擇出來。一般都利用各種生化指標(biāo)和遺傳標(biāo)記來選擇和鑒定。例如，使用天然的或人工誘變的突變體，如白化苗、營養(yǎng)缺陷型、抗藥性突變體等，或根據(jù)不同材料對(duì)激素敏感性不同，生長(zhǎng)差異等，來設(shè)計(jì)適合的選擇系統(tǒng)。如果融合的原生質(zhì)體一個(gè)是白化，另一個(gè)具葉綠體,就可用機(jī)械的方法，把融合的細(xì)胞在倒置顯微鏡下把它們挑選出來進(jìn)行培養(yǎng)。這些細(xì)胞培養(yǎng)到各個(gè)發(fā)育階段，如愈傷組織、分化苗和根，都需要更換培養(yǎng)基，才能使它們順利地再生成植株。

7細(xì)胞工程的基本操作

細(xì)胞工程的基本操作有細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞拆合技術(shù)、染色體及染色體工程技術(shù)、體外受精和胚胎移植技術(shù)等，在食品工業(yè)中應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞工程技術(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)以及細(xì)胞拆合技術(shù)。[2]

8應(yīng)用

細(xì)胞工程作為科學(xué)研究的一種手段，已經(jīng)滲入到生物工程的各個(gè)方面，成為*的配套技術(shù)。在農(nóng)林、園藝和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中，細(xì)胞工程正在為人類做出巨大的貢獻(xiàn)。

糧食與蔬菜生產(chǎn)

利用細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行作物育種，是迄今人類受益多的一個(gè)方面。中國在這一領(lǐng)域已達(dá)到*水平，以花藥單倍體育種途徑，培育出的水稻品種或品系有近百個(gè)，小麥有30個(gè)左右。其中河南省農(nóng)科院培育的小麥新品種，具有抗倒伏、抗銹病、抗白粉病等優(yōu)良性狀。

在常規(guī)的雜交育種中，育成一個(gè)新品種一般需要8～10年，而用細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)雜種的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，可大大縮短育種周期，一般提前2～3年，而且有利優(yōu)良性狀的篩選。前面已介紹過的微繁殖技術(shù)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也有廣泛的用途，其技術(shù)比較成熟，并已取得較大的經(jīng)濟(jì)效益。例如，中國已解決了馬鈴薯的退化問題，日本麒麟公司已能在1000升容器中大量培養(yǎng)無病毒微型馬鈴薯塊莖作為種薯，實(shí)現(xiàn)種薯生產(chǎn)的自動(dòng)化。通過植物體細(xì)胞的遺傳變異，篩選各種有經(jīng)濟(jì)意義的突變體，為創(chuàng)造種質(zhì)資源和新品種的選育發(fā)揮了作用。現(xiàn)已選育出的番茄、抗寒的亞麻、以及水稻、小麥、玉米等新品系。有希望通過這一技術(shù)改良作物的品質(zhì)，使它更適合人類的營養(yǎng)需求。

蔬菜是人類膳食中*的成分，它為人體提供必需的維生素、礦物質(zhì)等。蔬菜通常以種子、塊根、塊莖、插扦或分根等傳統(tǒng)方式進(jìn)行繁殖，化費(fèi)成本低。但是，在引種與繁育、品種的種性提純與復(fù)壯、育種過程的某些中間環(huán)節(jié)，植物細(xì)胞工程技術(shù)仍大有作為。例如，從國外引進(jìn)蔬菜新品種，初往往只有幾粒種子或很少量的塊根、塊莖等。要進(jìn)行大規(guī)模的種植，必須先大量增殖，這就可應(yīng)用微繁殖技術(shù)，在較短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)大群體。在常規(guī)育種過程中，也可應(yīng)用原生質(zhì)體或單倍體培養(yǎng)技術(shù)，快速繁殖后代，簡(jiǎn)化制種程序。另外，還可結(jié)合植物基因工程技術(shù)，改良蔬菜品種。

園林花卉

在果樹、林木生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)主要是微繁殖和去病毒技術(shù)。幾乎所有的果樹都患有病毒病，而且多是通過營養(yǎng)體繁殖代代相傳的。用去病毒試管苗技術(shù)，可以有效地防止病毒病的侵害，恢復(fù)種性并加速繁殖速度。目前，香蕉、柑橘、山楂、葡萄、桃、梨、荔枝、龍眼、核桃等十余種果樹的試管苗去病毒技術(shù)，已基本成熟。香蕉去病毒試管苗的微繁殖技術(shù)已成為產(chǎn)業(yè)化商品化的先例之一。因?yàn)橄憬妒侨扼w植物，必須通過無性繁殖延續(xù)后代，傳統(tǒng)方法一般采用芽繁殖，感病嚴(yán)重，繁殖率低；而采用去病毒的微繁殖技術(shù)不僅改進(jìn)了品質(zhì)，畝產(chǎn)量約提高30%～50%，很容易被蕉農(nóng)接受。

近年來，對(duì)經(jīng)濟(jì)林木組織培養(yǎng)技術(shù)的研究也受到很大的重視。采用這一技術(shù)可比常規(guī)方法提前數(shù)年進(jìn)行大面積種植。特別是有些林木的種子休眠期很長(zhǎng)，常規(guī)育種十分費(fèi)時(shí)。據(jù)不*統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)已研究成功的林木植物試管苗已達(dá)百余種，如松屬、桉樹屬、楊屬中的許多種，還有泡桐、槐樹、銀杏、茶、棕櫚、咖啡、椰子樹等。其中桉樹、楊樹和花旗松等大面積應(yīng)用于生產(chǎn)，澳大利亞已實(shí)現(xiàn)桉樹試管苗造林，用幼芽培養(yǎng)每年可繁殖40萬株。

植物細(xì)胞工程技術(shù)使現(xiàn)代花卉生產(chǎn)發(fā)生了革命性的變化。1960年，科學(xué)家利用微繁殖技術(shù)將蘭花的愈傷組織培養(yǎng)成植株后，很快形成了以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的工業(yè)化生產(chǎn)體系——蘭花工業(yè)?，F(xiàn)在，世界蘭花市場(chǎng)上有150多種產(chǎn)品，其中大部分都是用快速微繁殖技術(shù)得到的試管苗。從此，市場(chǎng)供應(yīng)擺脫了氣候、地理和自然災(zāi)害等因素的限制。至今，已報(bào)道的花卉試管苗有360余種。已投入商業(yè)化生產(chǎn)的有幾十種。中國對(duì)康乃馨、月季、唐昌蒲、菊花、非洲紫羅蘭等品種的研究較為成熟，有的也已商品化，并有大量產(chǎn)品銷往港澳及東南亞地區(qū)。

臨床醫(yī)學(xué)與藥物

自1975年英國劍橋大學(xué)的科學(xué)家利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)獲得單克隆抗體以來，許多人類無能為力的病毒性疾病遇到了克星。用單克隆抗體可以檢測(cè)出多種病毒中非常細(xì)微的株間差異，鑒定細(xì)菌的種型和亞種。這些都是傳統(tǒng)血清法或動(dòng)物免疫法所做不到的，而且診斷異常準(zhǔn)確，誤診率大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的單克隆抗體，其靈敏度比當(dāng)前佳的抗血清還要高100倍，能檢測(cè)出抗血清的60%的假陰性。

近年來，應(yīng)用單克隆抗體可以檢查出某些還尚無臨床表現(xiàn)的極小腫瘤病灶，檢測(cè)心肌梗死的部位和面積，這為有效的治療提供方便。單克隆抗體并已成功地應(yīng)用于臨床治療，主要是針對(duì)一些還沒有藥的病毒性疾病，尤其適用于抵抗力差的兒童。人們正在研究“生物導(dǎo)彈”——單克隆抗體作載體攜帶藥物，使藥物準(zhǔn)確地到達(dá)癌細(xì)胞，以避免化療或放射療法把正常細(xì)胞與癌細(xì)胞一同殺死的副作用。

單克隆抗體可以地檢測(cè)排卵期。新一代免疫避孕藥也在研制之中，其基本原理是用精子，卵透明帶或早期胚胎來制備單克隆抗體，將它們注入婦女體內(nèi)，人體就會(huì)產(chǎn)生對(duì)精子的免疫反應(yīng)，從而起到避孕作用。人類體外受精技術(shù)的日趨成熟，使人類對(duì)生育活動(dòng)有了較大的選擇余地，促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)，也為不孕癥患者或不宜生育的人帶來福音。

生物藥品主要有各種疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物質(zhì)，抗體等，是生物體內(nèi)代謝的中間產(chǎn)物或分泌物。過去制備疫苗是從動(dòng)物組織中提取，得到的產(chǎn)量低而且很費(fèi)時(shí)?，F(xiàn)在，通過培養(yǎng)、誘變等細(xì)胞工程或細(xì)胞融合途徑，不僅大大提高了效率，還能制備出多價(jià)菌苗，可以同時(shí)抵御兩種以上的病原菌的侵害。用同樣的手段，也可培養(yǎng)出能在培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期生長(zhǎng)、分裂并能分泌某種激素的細(xì)胞系。1982年美國科學(xué)家用誘變和細(xì)胞雜交手段，獲得了可以持續(xù)分泌干擾素的體外培養(yǎng)細(xì)胞系，現(xiàn)已走向應(yīng)用。

繁育優(yōu)良品種

目前，人工受精、胚胎移植等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。精液和胚胎的液氮超低溫（-196攝氏度）保存技術(shù)的綜合使用，使優(yōu)良公畜、禽的交配數(shù)與交配范圍大為擴(kuò)展，并且突破了動(dòng)物交配的季節(jié)限制。另外，可以從優(yōu)良母畜或公畜中分離出卵細(xì)胞與精子，在體外受精，然后再將人工控制的新型受精卵種植到種質(zhì)較差的母畜子宮內(nèi)，繁殖優(yōu)良新個(gè)體。綜合利用各項(xiàng)技術(shù)，如胚胎分割技術(shù)、核移植細(xì)胞融合技術(shù)、顯微操作技術(shù)等，在細(xì)胞水平改造卵細(xì)胞，有可能創(chuàng)造出高產(chǎn)奶牛、瘦肉型豬等新品種。特別是干細(xì)胞的建立，更展現(xiàn)了美好的前景。

9圖書信息

書名：細(xì)胞工程

作　者：潘求真

出版社：哈爾濱工程大學(xué)出版社

出版時(shí)間：2009-7-1

ISBN: 9787811334883

開本：16開

定價(jià)： 45.00元

內(nèi)容簡(jiǎn)介

細(xì)胞工程是細(xì)胞水平的生物技術(shù)，也是該領(lǐng)域中先應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐并取得顯著效益的應(yīng)用學(xué)科。本書較全面、系統(tǒng)地介紹了細(xì)胞工程的基本原理、基本技術(shù)及其應(yīng)用以及學(xué)科的新研究成果。全書共分細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)、植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程、微生物細(xì)胞工程和組織細(xì)胞工程等共二十章。各章在全面總結(jié)已有研究成果的基礎(chǔ)上，著重對(duì)其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用狀況和原理進(jìn)行全面的介紹。每章后面附有思考題以便于學(xué)生復(fù)習(xí)掌握。

本書可用作綜合院校、師范院校以及農(nóng)林院校生物技術(shù)、生物工程及其他生命科學(xué)專業(yè)的細(xì)胞工程課程的教材，也可供其他院校有關(guān)專業(yè)的相關(guān)課程選用，同時(shí)也適用于生物及醫(yī)學(xué)研究人員閱讀參考使用。

圖書目錄

編細(xì)胞工程基礎(chǔ)

第二章細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及基本技術(shù)

第二編植物細(xì)胞工程

第三章植物細(xì)胞工程的基本原理

第四章植物組織培養(yǎng)與器官培養(yǎng)

第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)

第六章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合

第七章人工種子

第八章植物離體培養(yǎng)下的遺傳變異與種質(zhì)離體保存

第九章細(xì)胞工程的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)

第十章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第十二章細(xì)胞融合

第十三章染色體工程

第十四章胚胎工程

第十五章克隆動(dòng)物

第十六章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

第十七章干細(xì)胞技術(shù)

第十八章組織工程

第十九章細(xì)胞工程的應(yīng)用

第二十章微生物細(xì)胞工程

附錄

參考文獻(xiàn)

參考資料

1. 《細(xì)胞分化》的教學(xué)設(shè)計(jì) ．江西教師網(wǎng)．2013-1-29 [引用日期2013-05-28]
2. 王永飛、馬三梅、李宏業(yè)．細(xì)胞工程：科學(xué)出版社，2009

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