大米是世界上半以上人口的主食。由于其無(wú)麩質(zhì)和礦物質(zhì)含量高，大米的粉狀食品通常是第一批給嬰兒食用的固體食品之—。它也是很受乳糜瀉患者和無(wú)麩質(zhì)飲食者歡迎的谷物。然而，近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注大米中砷含量高的問(wèn)題，這種致癌的非金屬含量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)環(huán)境中的濃度。1大米中砷的潛在來(lái)源有很多，如種植稻米的土壤、灌溉用水以及大氣沉降物。土壤和水中的高濃度砷可能是因?yàn)樵摰貐^(qū)的自然地質(zhì)和對(duì)這種非金屬的瀝濾造成的，也可能是經(jīng)過(guò)各種不同的人為活動(dòng)造成的。2
無(wú)機(jī)砷形態(tài)(As Ill和As V)是砷在地面環(huán)境存在的普遍形式，也是毒性最強(qiáng)的。稻田中常見(jiàn)的還原性和缺氧條件可以促進(jìn)某些As形態(tài)向常見(jiàn)的有毒和致癌性As形態(tài)(As Ill)轉(zhuǎn)化還原。當(dāng)周邊環(huán)境中的As被水稻吸收后，它可能會(huì)被代謝并甲基化成毒性較小的As形態(tài)，而這種甲基化的程度很大程度上取決于植物的部位(根、芽、葉和種子)。因此，如果要評(píng)估水稻作物中砷的總濃度，這將僅僅研究水稻中砷的所有不同形態(tài)，可能導(dǎo)致我們對(duì)其潛在毒性得出不準(zhǔn)確的結(jié)論。正是這個(gè)原因形態(tài)研究才有必要。
因?yàn)橹袊?guó)是世界上最大的大米生產(chǎn)國(guó)，中國(guó)政府發(fā)布了《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5009.11-2014)，幫助評(píng)估大米和大米制品中的砷形態(tài)。在此文件中，確定HPLC-ICP-MS為首選的分析技術(shù)。2017年，中國(guó)發(fā)布了GB 2762，規(guī)定了無(wú)機(jī)砷含量的最高允許濃度(0.2 mg/kg)。許多砷形態(tài)分析方法中遇到的挑戰(zhàn)之是需要一種能夠控制各種砷形態(tài)洗脫的溶劑梯度。這需要一個(gè)能精確阻抗匹配的穩(wěn)定等離子體，它能夠處理溶劑梯度的變化及可能對(duì)電離的影響。另外，由于該方法可能增加泵密封件的磨損，因此具有能夠在泵密封件后部進(jìn)行有效清洗的機(jī)械泵將大大減少密封件的損壞，從而減少了停機(jī)時(shí)間和維護(hù)工作量。
在本研究中，使用梯度陰離子交換法根據(jù)GB 5009.11對(duì)商業(yè)大米樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的五種砷形態(tài)進(jìn)行了表征。分析使用了珀金埃爾默NexSAR™ HPLC-ICP-MS形態(tài)解決方案，它由NexSAR惰性HPLC和NexlON® ICP-MS構(gòu)成。
實(shí)驗(yàn)
樣品制備
用以下試劑在0.15 M HNO3中(超純，68%，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司，中國(guó)江蘇蘇州)制備濃度為0.2、1、5、50和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液：
?亞砷酸鹽As Ill(75.5±1.2 μg/g)、砷酸鹽As V(17.5±0.4 μg/g)、一甲基胂(MMA；25.1±0.8 μg/g)；
?二甲基砷(DMA；52.9±1.8 μg/g)和砷甜菜堿(AsB；38.8±1.1 μg/g)(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，中國(guó)北京)。
選擇這些形態(tài)進(jìn)行評(píng)估是因?yàn)閲?guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及它們?cè)诖竺字械母吆恳?。?biāo)準(zhǔn)溶液濃度按照GB 5009.11中規(guī)定的建議濃度進(jìn)行配制。按照對(duì)每種砷形態(tài)單獨(dú)分析的洗脫時(shí)間確定其形態(tài)。
商業(yè)大米從當(dāng)?shù)厣痰曩?gòu)買(mǎi)作為進(jìn)行分析的樣品，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CRM，GBW(E)100348，中國(guó)北京)用于方法驗(yàn)證。
?將樣品(0.5g)在分析天平(梅特勒-托利多，美國(guó)俄亥俄州哥倫布)上精確稱(chēng)量，三份，考慮了樣品中的不均勻性，并放入15mL聚丙烯試管中(美國(guó)紐約市康馬克市科晶)。
?將硝酸(10 mL0.15M HNO3)加入每個(gè)樣品中，并用試管攪拌，確保樣品完全浸入酸中。
?此后，將樣品放入90℃干燥箱中(DHG-9000，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)上海)三小時(shí)，每半小時(shí)搖晃1分鐘。
?取出后，冷卻樣品，用離心機(jī)(TDL-60B，上海安亭科學(xué)儀器廠，中國(guó)上海)8000轉(zhuǎn)速離心15分鐘。
?倒出上層清液用0.45 μm注射器式濾器(聚四氟乙烯，親水，Millex，Sigma Aldrich™，美國(guó)密蘇里州圣路易斯市)過(guò)濾，去除顆粒物質(zhì)。
用與制備樣品相同的方式制備方法空白樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從而確保分析的準(zhǔn)確性。作為方法考察的一部分，對(duì)加標(biāo)大米樣品(所有砷形態(tài)5 μg/L)進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步驗(yàn)證樣品中關(guān)于個(gè)別砷形態(tài)的分析方法。
流動(dòng)相用HNO3(蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司)，H3PO4 (85%，美國(guó)飛世爾科技，美國(guó)新罕布什爾州漢普頓)和NH4OH(≥25%，西格瑪奧德里奇，美國(guó)馬薩諸塞州柏林頓)制備。在分析中，將標(biāo)準(zhǔn)溶液、大米提取物、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和空白樣品倒入無(wú)金屬聚丙烯HPLC小瓶中，并在不稀釋的情況下進(jìn)行分析。為了說(shuō)明色譜基線梯度的變化，將旁路樣品(只進(jìn)流動(dòng)相)作為分析順序的一部分進(jìn)行分析，并從空白、樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖中減去。
儀器
所有分析使用NexSAR形態(tài)分析HPLC系統(tǒng)(珀金埃爾默公司，美國(guó)康涅狄格州謝爾頓市)，它由NexSAR 200惰性HPLC泵、冷卻惰性自動(dòng)進(jìn)樣器和帶脫氣器的容積盤(pán)組成。此系統(tǒng)和NexlON ICP-MS(珀金埃爾默)一起使用。關(guān)于HPLC和ICP-MS的儀器條件分別如表1和表2所示。樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)模式下操作，在標(biāo)準(zhǔn)模式下，用校正方程來(lái)補(bǔ)償ArCI+多原子干擾。所有分析和數(shù)據(jù)收集使用Clarity™色譜軟件(DataApex，布拉格，捷克共和國(guó))操作。
表1.NexSAR惰性HPLC條件
表2.NexlON ICP-MS條件
結(jié)果與討論
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(0.2-100 μg/L，n=6)的相關(guān)系數(shù)分別為0.999965、0.999979、0.999999、0.99999和0.999989(圖1a-e)，表明大米中的砷在GB 5009.11規(guī)定的預(yù)期濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。
圖1.流動(dòng)相(pH值為8.6)中的(a)AsB、(b)As IIl、(C)DMA、(d)MMA和(e)As V濃度范圍為0.2-100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸和相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(點(diǎn)擊查看大圖)
0.2-100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖的重疊(圖2)表明惰性HPLC泵出的流體具有一致性、可靠性和復(fù)現(xiàn)性，從而確保色譜峰保持尖銳且能正確識(shí)別，實(shí)現(xiàn)良好的準(zhǔn)確度和信噪比(S/N)。
圖2.pH值為8.6的流動(dòng)相中標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2-100 μg/L)(點(diǎn)擊查看大圖)
使用規(guī)定的流動(dòng)相測(cè)出AsB、As IlI、DMA、MMA和As V的50 ng/L標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(圖3)的信噪比分別為15、13、13、17和23，其中As IlI和DMA的理論檢測(cè)限為11.5 ng/L、6.5 ng/L為As V、MMA為8.8 ng/L和AsB為10 ng/L。
圖3.50 ng/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(減去旁路的)(點(diǎn)擊查看大圖)
未加標(biāo)大米樣品、加標(biāo)(5 μg/L)大米樣品和10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的譜圖重疊如圖4所示。此重疊圖表明，樣品基質(zhì)對(duì)不同砷形態(tài)的保留時(shí)間無(wú)影響，通過(guò)精確的泵流速保證了方法的穩(wěn)定和重現(xiàn)性。
圖4.大米樣品、加標(biāo)大米樣品和10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖疊加(減去旁路的)(點(diǎn)擊查看大圖)
AsB、As llI、DMA、MMA和As V的加標(biāo)回收率良好，分別為105、92、95、97和96%(圖5)，進(jìn)一步驗(yàn)證了此方法，并證明了樣品基質(zhì)中每種單獨(dú)的砷形態(tài)的準(zhǔn)確性。
圖5.大米提取物中AsB、As III、DMA、MMA和As V加標(biāo)5 μg/L的加標(biāo)回收率(點(diǎn)擊查看大圖)
此方法還通過(guò)使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100348)進(jìn)行了驗(yàn)證，其中圖6顯示了有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖重疊情況。有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同，無(wú)機(jī)砷的回收率為100%，總砷含量回收率為99%，進(jìn)一步證實(shí)了該方法分析的準(zhǔn)確性。
圖6.與10 μg/L疊加的GBW(E)100348有證標(biāo)準(zhǔn)溶液(減去旁路的)色譜圖(點(diǎn)擊查看大圖)
使用這種方法對(duì)從當(dāng)?shù)厣痰曩?gòu)買(mǎi)的大米樣品中As形態(tài)濃度進(jìn)行了評(píng)估(表3)。As IIl、As V和DMA均高于方法檢測(cè)限值，其中無(wú)機(jī)砷的總量(As Ill和As V)低于0.2 mg/kg的規(guī)定限值(GB 2762)。AsB和MMA都低于方法檢出限，這里沒(méi)有進(jìn)行記錄。
表3.商業(yè)大米樣品中的砷形態(tài)濃度
*BD：低于檢出限
結(jié)論
本研究根據(jù)GB 5009.11提出的方法使用NexSAR惰性HPLC系統(tǒng)和NexlON ICP-MS評(píng)估大米樣品中的砷形態(tài)、加標(biāo)大米樣品和大米有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
結(jié)果顯示，使用該形態(tài)分析解決方案和梯度洗脫法能簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地定量低含量砷形態(tài)濃度。其中，NexlON穩(wěn)定的等離子體和HPLC泵確保精確的流動(dòng)相流速是實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的關(guān)鍵。在評(píng)估的商業(yè)大米中，發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)砷含量低于規(guī)定量。
消耗品
參考文獻(xiàn)
1. Heikens， A.， 2006. Arsenic Contamination of Irrigation Water， Soil and Crops in Bangladesh: Risk Implications for Sustainable Agriculture and Food Safety in Asia. Food and Agricultural Organization of the United Nations， Regional Office for Asia and the Pacific.
2. ATSDR， 2013. Arsenic Toxicity: Where is Arsenic Found?
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