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ELISA出現(xiàn)“花板”原因及解決辦法

來源:上海撫生實業(yè)有限公司   2022年08月22日 14:08  

    酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)于1971年分別由瑞典學(xué)者和荷蘭學(xué)者報道,開創(chuàng)了運用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測定的實驗方法。其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),由此進行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高,特異性較好,操作較簡單,可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而,“花板”現(xiàn)象的出現(xiàn),往往會給實驗者判讀結(jié)果帶來麻煩。所謂“花板”,就是空白、陰性、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,而標(biāo)本孔的OD值卻偏高,弱陽性結(jié)果較多?,F(xiàn)對“花板”現(xiàn)象進行了分析和總結(jié),認(rèn)為花板原因大多在樣品,解決辦法主要在洗滌,孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。
 

 一、 花板原因大多在樣品
  所謂“花板”,就是空白、陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,而標(biāo)本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常,是因為樣品本身的原因,大部分或全部標(biāo)本孔的OD值偏高,很可能是因為樣品中某些共有的物質(zhì)非特異性的吸附于固相載體,而在實驗的過程中未被除去。
  1、待測血清中混有紅細胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈,李文,卓瑪?shù)热耍?,2]實驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長的離心時間(>10 min)之下,血液標(biāo)本被充分地離心分離之后,使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀,可以在加樣時避免加入紅細胞和纖維蛋白,避免這兩種干擾物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響,就可避免“花板”情況。
 2、 高IgG血癥 在實際工作中,筆者發(fā)現(xiàn),檢測丙肝的實驗出現(xiàn)花板的情況較多,原因之一是因為目前國內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理,間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG,IgG對聚苯乙烯有較強的吸附力,非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性。
 

二、 解決辦法主要在洗滌
  聚苯乙烯因其具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實驗的固相載體,聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,因此需要通過洗滌清除在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻決定著實驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細胞或纖維蛋白原,可以在加樣前離心時得到控制,同樣也可以通過適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對實驗結(jié)果的影響,同樣,對于血液存在的非特異性的IgG,實驗者很難在加樣時將其去除,那么解決的最佳時機就是洗滌過程。
  

   ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點:

1、板要平整,尤其是在用洗板機洗板的過程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有殘留,從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈,對實驗結(jié)果造成干擾。

2、洗液溫度,實驗表明,洗液溫度也會影響洗板的干凈程度,尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板"問題。因此,最好保持室溫在20℃-30℃。

3、洗液要注滿孔,孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。

4、洗液要新鮮配置,洗液要臨用前新鮮配制,放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁,造成賭孔或花板。

5、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成“花板"。


  三、 孵育時間過長也會造成“花板”
  本實驗室曾有一段時間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測“花板”現(xiàn)象,究其原因是由于樣本較多,加樣后未及時放入孵育箱,反應(yīng)板在室溫呆的時間過長,即間接增加了孵育時間,導(dǎo)致孵育時間過長,蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此,應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時間,加樣后及時孵育,標(biāo)本較多時可分批操作。
  此外,有些的試劑顯色液不穩(wěn)定,使用前容易變藍,如在實驗前不仔細檢查,很容易導(dǎo)致“花板”現(xiàn)象的發(fā)生,這也提醒實驗者應(yīng)使用新鮮的顯色液,很大程度的保證實驗的準(zhǔn)確性。
 

    綜上所述,將ELISA“花板”現(xiàn)象總結(jié)為:花板原因大多在樣品,解決辦法主要在洗滌,孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。既然原因大多在樣品,那么在樣品交接時應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,無溶血,無凝血,足量,單個的溶血樣品雖不致造成“花板”,但血紅蛋白中的血紅素基團,具有類過氧化物的活性,在以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測定中,易在孵育過程中吸附于固相,從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色,從而造成假陽性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟,充分有效的洗滌也是避免“花板”的有利措施。同樣,嚴(yán)格按照試劑說明孵育,使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板”的保障。以上措施可以有效減少“花板”次數(shù),從而提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性,更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢。


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