脂質(zhì)是生物體重要的結(jié)構(gòu)基石和功能分子。以甘油磷脂、膽固醇為核心的脂質(zhì)分子組成細(xì)胞膜雙分子層結(jié)構(gòu)，為生命活動(dòng)提供穩(wěn)定的物理屏障和微環(huán)境；而甘油三酯直接參與能量動(dòng)員和新陳代謝，神經(jīng)酰胺、類花生酸和磷脂酰肌醇是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)。因此，全面表征脂質(zhì)結(jié)構(gòu)有助于揭示脂質(zhì)與其他生物分子復(fù)雜的功能網(wǎng)絡(luò)。
脂質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)表征通常包含如下多個(gè)層級(jí)的結(jié)構(gòu)信息[1,2]：1) 確定脂質(zhì)種類(主要通過識(shí)別脂質(zhì)的頭基)；2)確定脂質(zhì)亞類(通過識(shí)別脂肪酸連接方式確認(rèn)屬于醚脂、縮醛磷脂或酰基脂等)；3)脂質(zhì)分子的總體脂肪酸水平；4)脂質(zhì)分子各?；舅崴剑?)不飽和脂肪鏈碳碳雙鍵(C=C)位置和立體構(gòu)型、其他修飾(如甲基、環(huán)丙基、羥基等)位置；6)脂肪酸鏈sn位置(圖1)。其中，高分辨質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)實(shí)現(xiàn)前四個(gè)水平的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，但對(duì)于表征脂質(zhì)C=C和sn位置仍存在巨大挑戰(zhàn)。
圖1. 脂質(zhì)分子的鑒定水平(點(diǎn)擊查看大圖)
1 Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ 三合一質(zhì)譜全面解析脂質(zhì)結(jié)構(gòu)
以磷脂酰膽堿(PC)為例，傳統(tǒng)LC-MS分析中PC在正離子模式下只能得到頭基離子(m/z 184.07)的碎片(圖2上)，并不能得到脂肪酸鏈的組成信息，因此通常需要結(jié)合負(fù)離子模式確定酰基組成。在Orbitrap™ Tribrid™ 三合一系列質(zhì)譜中, 除了應(yīng)用常規(guī)beam-type HCD碎裂得到頭基信息外，還可以利用阱內(nèi)CID(ion-trap CID)直接在一針正模式分析中獲得完整脂肪酸組成信息，極大提高脂質(zhì)組學(xué)的分析通量(圖2下)。
圖2.PC(16:0/18:1)的HCD(上)和CID(下)正模式MS/MS譜圖。在HCD模式下，只能觀測到頭基離子信號(hào)；而在CID譜圖中，可以觀測到FA(16:0)和FA(18:1)中性丟失離子，從而獲得PC(16:0/18:1)分子組成。
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再如甘油三酯(TG)的結(jié)構(gòu)解析中，二級(jí)質(zhì)譜只能在中性丟失水平上推測TG三條脂肪酸鏈可能的組成信息， 但針對(duì)共流出的異構(gòu)體物種缺乏分辨能力。例如雖然TG(48:1) MS2譜圖可以通過FA(18:1), FA(16:0) 和FA (14:0) 三條?；溨行詠G失推斷該TG為TG(14:0/16:0/18:1)。但利用Orbitrap三合一質(zhì)譜的多級(jí)質(zhì)譜分析功能，可以在MS3譜圖層面輕松分辨出其中共流出的TG(16:1/16:0/16:0) 分子種，極大提高TG分子的鑒定深度(圖3)。
圖3.TG(48:1)分子的結(jié)構(gòu)表征。MS2需要通過三條脂肪鏈中性丟失離子的排列組合推斷其分子組成，但對(duì)于共流出的異構(gòu)體無分辨能力。而通過MS3分析可以進(jìn)一步得到脂肪酸鏈診斷離子，特別是對(duì)共流出TG的鑒定具有重要作用(點(diǎn)擊查看大圖)
基于此，針對(duì)復(fù)雜脂質(zhì)組學(xué)分析，我們?cè)贠rbitrap™ IQ-X™ Tribrid™ 三合一質(zhì)譜中搭建了如圖4所示的質(zhì)譜分析模板用于非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。首先對(duì)傳統(tǒng)HCD-MS2譜圖快速掃描，針對(duì)PC頭基離子觸發(fā)CID-MS2補(bǔ)充其脂肪鏈組成信息；針對(duì)TG的特定中性丟失觸發(fā)HCD-MS3提供更精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)注釋。
圖4.完整脂質(zhì)組學(xué)分析質(zhì)譜模板
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2 UVPD精確表征甘油磷脂C=C位置
脂質(zhì)的雙鍵結(jié)構(gòu)顯著影響生物膜通透性和內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡，大量研究證實(shí)表征脂質(zhì)C=C位置有助于了解細(xì)菌耐藥和腫瘤發(fā)生發(fā)展。脂質(zhì)的C=C在200nm的波長范圍內(nèi)存在一定的紫外吸收，因此193nm和213nm的紫外光解離(UVPD)技術(shù)在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)深度表征方面起到了重要作用。Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ 三合一系列質(zhì)譜(如IQ-X，Ascend等型號(hào))可附加UVPD模塊用于脂質(zhì)C=C位置的深度表征(圖5)。該模塊將213nm紫外光照射進(jìn)入雙壓線性離子阱，被離子阱捕獲的脂質(zhì)C=C雙鍵在吸收光子后發(fā)生π-π*躍遷進(jìn)入激發(fā)態(tài)，誘導(dǎo)鄰位C-C鍵斷裂，形成一對(duì)相差24Da的診斷離子，從而指認(rèn)C=C位置[2](圖5)。
圖5. UVPD可作為附加模塊配置在Orbitrap™ IQ-X™等三合一系列質(zhì)譜，UVPD工作原理以及分析C=C診斷離子
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以PC(16:0/18:1n-9)為例，在UVPD激發(fā)下C=C鄰位C-C斷裂，形成x+1炔離子和x-1烷基離子，這兩個(gè)診斷離子分子量相差24Da,可用于C=C雙鍵位置(x)的確認(rèn)[4]。相比于其他碎裂方式，UVPD對(duì)C=C的碎裂更具有選擇性，診斷離子附近無其他干擾離子，即使需要放大譜圖查找，也極易識(shí)別(圖6)。在真實(shí)的鼠腦組織中，UVPD成功鑒定出PC(18:1/18:1)的三種C=C異構(gòu)體，包括PC(18:1 n-9/18:1 n-9)、PC(18:1 n-7/18:1 n-7)、PC(18:0/18:2n-6,9)等(圖7)。
圖6. PC(16:0/18:1n-9)標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣本UVPD-MS2譜圖。UVPD激發(fā)可以誘導(dǎo)C=C鄰位斷裂，形成質(zhì)量數(shù)相差24Da的雙鍵診斷離子(點(diǎn)擊查看大圖)
圖7. 真實(shí)小鼠腦組織樣本中PC(18:1/18:1)雙鍵異構(gòu)體鑒定和表征(點(diǎn)擊查看大圖)
3 UVPD 用于脂質(zhì)sn位置的深度表征
磷脂的兩條脂肪鏈的sn位置反映了脂質(zhì)從頭合成過程，但LC-MS通常難以分離sn異構(gòu)體。磷脂酶A(PLA1和PLA2)選擇性水解法雖然可以成功鑒定sn異構(gòu)體，但檢測通量較低。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰膽堿的堿金屬加合離子在HCD/CID解離后會(huì)丟掉頭基離子，通過重排反應(yīng)形成的二氧戊環(huán)結(jié)構(gòu)，UVPD會(huì)特異性切斷sn-2位置脂肪酸鏈，得到僅含sn-1脂肪酸鏈的診斷離子，因此可以用于磷脂和TG的sn-異構(gòu)體鑒定[5]。UVPD-MS3無需放大譜圖即可識(shí)別特征sn異構(gòu)離子，可用于常規(guī)非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析工作流。
圖8. PC(16:0/18:1)sn結(jié)構(gòu)鑒定，選擇堿金屬加合離子[M+Na]+產(chǎn)生的HCD/CID-MS2譜圖中[M+Na-183]+碎片離子，進(jìn)一步觸發(fā)UVPD-MS3，可以得到選擇性sn-1脂肪鏈結(jié)構(gòu)信息，從而推測PC的sn位置
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4 相關(guān)應(yīng)用文獻(xiàn)
（1）UVPD全面表征甘油磷脂結(jié)構(gòu)
甘油磷脂(GPLs)是細(xì)胞膜主要成分之一，顯著影響細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性，細(xì)菌通過調(diào)控甘油磷脂改變細(xì)胞膜表面電荷從而影響抗生素耐藥。其中，磷脂的環(huán)丙基修飾與結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)，但傳統(tǒng)的CID/HCD技術(shù)無法表征環(huán)丙基結(jié)構(gòu)的位置?？紤]到環(huán)丙烷基在200nm波長附近也存在紫外吸收，德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的研究小組利用UVPD技術(shù)輕松誘導(dǎo)環(huán)丙基鄰位C-C鍵斷裂產(chǎn)生間隔14Da的診斷離子對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)丙基磷脂的精確定位，并在大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌中鑒定出一系列未曾報(bào)道的甘油磷脂環(huán)丙基修飾結(jié)構(gòu)(圖9上)。隨后，該小組應(yīng)用HCD/UVPD對(duì)細(xì)菌GPLs進(jìn)行了綜合、全面的結(jié)構(gòu)解析，闡明了細(xì)菌脂質(zhì)中不飽和鍵(碳碳雙鍵、環(huán)丙基)、羥基和烷基等修飾與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系[5,6](圖9下)。
圖9. 全面表征甘油磷脂結(jié)構(gòu)，包括C=C位置、環(huán)丙基位置、羥基位置等，揭示甘油磷脂不飽和鍵種類和分布于細(xì)菌耐藥機(jī)制的關(guān)系(點(diǎn)擊查看大圖)
（2）其他重要脂質(zhì)分子精細(xì)結(jié)構(gòu)解析
除了在正離子模式下表征GPLs外，UVPD也成功應(yīng)用于表征包括羥基脂肪酸酯[7]、鞘脂[8]、固醇[9]、糖脂[10,11]等脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。例如，心磷脂含有四條?；?，是一種復(fù)雜程度更高的脂質(zhì)，采用混合碰撞(CID×UVPD)方法可以精確定位心磷脂四個(gè)?；溙继茧p鍵和環(huán)丙基不飽和鍵的位置[12]，而通過化學(xué)衍生化結(jié)合HCD/UVPD可以進(jìn)一步解析心磷脂的sn-異構(gòu)體[13]，實(shí)現(xiàn)未知心磷脂結(jié)構(gòu)的從頭注釋(圖10)。除此之外，UVPD也被證實(shí)可以在負(fù)離子模式下應(yīng)用于游離脂肪酸和磷脂酰甘油(PG)等結(jié)構(gòu)表征[14]。
圖10. CID/HCD與UVPD混合碎裂用于心磷脂C=C雙鍵和sn位置的確認(rèn)(點(diǎn)擊查看大圖)
（3）DESI-UVPD用于不飽和磷脂的空間成像
解吸電噴霧電離(DESI)常用于脂質(zhì)分子的空間成像，但傳統(tǒng)MS1成像對(duì)同分異構(gòu)體的識(shí)別能力顯然不足。研究者利用UVPD活化脂質(zhì)產(chǎn)生的C=C診斷離子強(qiáng)度(Im/z 660+684)/(Im/z 688+712) 反映PC 16:0_18:1(n-9),和PC 16:0_18:1(n-7)]在腦組織切片中的分布，實(shí)現(xiàn)癌組織和癌旁組織區(qū)域的病理勾畫[15]。
圖11. DESI-UVPD-MS2用于脂質(zhì)C=C異構(gòu)體成像
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總 結(jié)
在生命科學(xué)研究中，脂質(zhì)分子以其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)多樣性承載細(xì)胞膜和物理屏障構(gòu)建、信號(hào)傳遞和能量代謝的核心使命。Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ 三合一系列質(zhì)譜重塑脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定的通量和深度，其通過多級(jí)質(zhì)譜解析和多重碎裂技術(shù)(HCD,CID,UVPD)突破脂質(zhì)分析的極限，實(shí)現(xiàn)在碳碳雙鍵、sn位置及酰基修飾模式等方面的深度洞察，從而終結(jié)脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的模糊解析，更好地助力全球科學(xué)家在代謝脂質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的科研突破。
參考文獻(xiàn)：
1. Ryan E, Reid GE. Chemical Derivatization and Ultrahigh Resolution and Accurate Mass Spectrometry Strategies for "Shotgun" Lipidome Analysis. Acc Chem Res. 2016;49(9):1596-1604.
2. Zhang W, Jian R, Zhao J, Liu Y, Xia Y. Deep-lipidotyping by mass spectrometry: recent technical advances and applications. J Lipid Res. 2022;63(7):100219.
3. Macias LA, Garza KY, Feider CL, Eberlin LS, Brodbelt JS. Relative Quantitation of Unsaturated Phosphatidylcholines Using 193 nm Ultraviolet Photodissociation Parallel Reaction Monitoring Mass Spectrometry. J Am Chem Soc. 2021;143(36):14622-14634.
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