發(fā)酵罐滅菌是確保純種培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，操作不當(dāng)可能導(dǎo)致雜菌污染、設(shè)備損壞或培養(yǎng)基成分破壞。以下是滅菌過(guò)程中需重點(diǎn)注意的事項(xiàng)，按滅菌前準(zhǔn)備、滅菌中操作、滅菌后處理三個(gè)階段展開(kāi)說(shuō)明：

一、滅菌前準(zhǔn)備：確保設(shè)備與物料狀態(tài)達(dá)標(biāo)

1. 檢查設(shè)備完整性  

  - 罐體與管路：  

    - 確認(rèn)罐體無(wú)裂縫、焊縫無(wú)滲漏（可通過(guò)打壓測(cè)試，如通入0.1 MPa壓縮空氣，保壓30分鐘，壓力下降＜5%視為合格）；  

    - 管路連接牢固，尤其是蒸汽進(jìn)口、排氣口、接種口等關(guān)鍵部位，避免蒸汽泄漏導(dǎo)致滅菌不徹-底或人員燙傷。  

  - 傳感器與閥門(mén)：  

    - pH電極、溶氧電極需拆卸或用保護(hù)套隔離（避免高溫?fù)p壞）；  

    - 所有閥門(mén)（如進(jìn)料閥、取樣閥）需處于開(kāi)啟狀態(tài)（除排氣閥外），確保蒸汽流通無(wú)-死角，尤其是死角區(qū)域（如攪拌軸與罐體連接處、噴嘴背側(cè)）。  

2. 培養(yǎng)基預(yù)處理  

  - 成分兼容性：  

    - 避免熱敏性物質(zhì)（如葡萄糖、維生素）與易分解物質(zhì)（如碳酸鈣、銨鹽）直接混合滅菌，可采用“分消法”：先對(duì)糖液?jiǎn)为?dú)滅菌（110℃、15分鐘），再與其他成分混合；  

    - 高黏度培養(yǎng)基（如含淀粉、蛋白胨）需適當(dāng)稀釋或預(yù)攪拌，防止滅菌時(shí)形成“固液分層”導(dǎo)致局部滅菌不徹-底。  

  - 裝液量控制：  

    - 實(shí)罐滅菌時(shí)，培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過(guò)罐體容積的70%（預(yù)留蒸汽上升空間），避免滅菌過(guò)程中液體隨蒸汽噴出堵塞排氣口。  

3. 空氣過(guò)濾系統(tǒng)檢查  

  - 好氧發(fā)酵罐滅菌前需確認(rèn)空氣過(guò)濾器（0.22 μm濾膜）已滅菌或更換（若為一次性濾器），避免滅菌后空氣倒吸時(shí)攜帶雜菌；  

  - 關(guān)閉空氣進(jìn)氣管路閥門(mén)，防止滅菌時(shí)蒸汽反沖入空氣壓縮機(jī)。  

二、滅菌中操作：嚴(yán)格控制溫度、壓力與時(shí)間

1. 升溫階段：排除冷空氣  

  - 避免“假壓”現(xiàn)象：  

    - 滅菌初期需全開(kāi)排氣閥，緩慢通入蒸汽，待罐內(nèi)冷空氣完-全排出（排氣口蒸汽呈連續(xù)柱狀、無(wú)白霧）后再關(guān)閉排氣閥，開(kāi)始升壓升溫；  

    - 若未排凈冷空氣，罐內(nèi)實(shí)際溫度會(huì)低于壓力表對(duì)應(yīng)溫度（如0.1 MPa表壓下，含空氣時(shí)實(shí)際溫度可能僅100℃，而非標(biāo)準(zhǔn)的121℃），導(dǎo)致滅菌不徹-底。  

2. 保溫階段：精準(zhǔn)維持滅菌條件  

  - 溫度與壓力匹配：  

    - 濕熱滅菌的標(biāo)準(zhǔn)條件為121℃、0.1 MPa（表壓）維持20~30分鐘（針對(duì)50 L以下罐體），大容積罐體需延長(zhǎng)至60分鐘以上；  

    - 實(shí)時(shí)監(jiān)控罐內(nèi)溫度與壓力，確保二者對(duì)應(yīng)（如0.05 MPa對(duì)應(yīng)108℃，0.15 MPa對(duì)應(yīng)128℃），若壓力波動(dòng)超過(guò)±0.02 MPa，需調(diào)整蒸汽流量。  

  - 攪拌與翻動(dòng)：  

    - 滅菌過(guò)程中可低速開(kāi)啟攪拌（10~20 rpm），推動(dòng)培養(yǎng)基流動(dòng)，避免底部沉積固體（如黃豆餅粉）因傳熱不均導(dǎo)致滅菌死角；  

    - 但需注意：攪拌軸封若為機(jī)械密封，高溫下可能因潤(rùn)滑油脂揮發(fā)導(dǎo)致泄漏，小型罐可手動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌軸代替。  

3. 避免“培養(yǎng)基焦化”  

  - 滅菌時(shí)若蒸汽通入過(guò)快，可能導(dǎo)致罐體底部局部過(guò)熱，培養(yǎng)基中的糖分與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成焦糊物（如葡萄糖焦化后生成5-羥甲基糠醛，抑制菌體生長(zhǎng)）；  

  - 預(yù)防措施：控制蒸汽流速，保持罐內(nèi)溫度上升速率≤3℃/分鐘，同時(shí)通過(guò)罐體夾套或盤(pán)管緩慢加熱，而非直接通入蒸汽沖擊底部。  

三、滅菌后處理：防止二次污染與設(shè)備損傷

1. 降壓與冷卻：控制速率防止倒吸  

  - 緩慢降壓：  

    - 滅菌結(jié)束后，先關(guān)閉蒸汽閥門(mén)，待罐內(nèi)壓力自然降至0.05 MPa以下，再緩慢開(kāi)啟排氣閥（開(kāi)度≤50%），避免因壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基沸騰噴料；  

    - 好氧發(fā)酵罐需在壓力降至接近零前，提前通入無(wú)菌空氣（經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾），維持罐內(nèi)正壓（0.01~0.03 MPa），防止外界空氣倒吸帶入雜菌。  

  - 冷卻方式選擇：  

    - 優(yōu)先采用夾套或盤(pán)管通水冷卻（水溫≤20℃），避免直接向罐體噴淋冷水（可能導(dǎo)致罐體驟冷變形，尤其玻璃罐易炸裂）；  

    - 冷卻過(guò)程中需持續(xù)監(jiān)測(cè)罐內(nèi)壓力，若壓力過(guò)低（接近負(fù)壓），需補(bǔ)充無(wú)菌空氣或氮?dú)狻? 

2. 無(wú)菌操作銜接  

  - 接種與取樣：  

    - 滅菌后所有操作需在火焰保護(hù)下進(jìn)行（如接種時(shí)將接種口置于酒精燈火焰旁，快速打開(kāi)并接入菌種）；  

    - 取樣閥需先用75%酒精擦拭，再用火焰灼燒滅菌，取樣后立即關(guān)閉閥門(mén)。  

  - 過(guò)濾器與管路維護(hù)：  

    - 空氣過(guò)濾器在滅菌后需檢查完整性（如進(jìn)行氣泡點(diǎn)測(cè)試：將濾膜浸入乙醇，通入空氣，觀察氣泡產(chǎn)生時(shí)的壓力是否≥設(shè)計(jì)值的80%）；  

    - 管路若需拆開(kāi)（如連接補(bǔ)料泵），接口處需用滅菌紗布包裹，或重新用酒精棉球擦拭滅菌。  

3. 設(shè)備清洗與保養(yǎng)  

  - 及時(shí)清洗：  

    - 滅菌后若培養(yǎng)基殘留罐壁或攪拌槳，需趁熱用溫水（40~50℃）沖洗（避免冷卻后固形物黏附難以清除），再用氫氧化鈉溶液（1%~2%）浸泡30分鐘，最后用清水沖至中性；  

    - 不銹鋼罐體避免使用鋼絲球擦洗，以防刮傷表面鈍化層，可用尼龍刷或海綿。  

  - 部件檢查：  

    - 檢查密封墊片（如O型圈）是否因高溫老化變形，若有裂紋需及時(shí)更換；  

    - 校準(zhǔn)溫度傳感器、壓力表（每年至少一次），確保下一批次滅菌參數(shù)準(zhǔn)確。  

四、特殊場(chǎng)景注意事項(xiàng)

1. 基因工程菌發(fā)酵罐  

  - 滅菌前需確認(rèn)生物安全閥門(mén)已開(kāi)啟（如帶有雙重密封的排氣閥），滅菌后排氣需經(jīng)高效過(guò)濾器（HEPA）處理，防止工程菌隨蒸汽擴(kuò)散；  

  - 若使用一次性發(fā)酵袋，滅菌方式改為輻照滅菌（如鈷-60照射），避免蒸汽濕熱破壞塑料材質(zhì)。  

2. 厭氧發(fā)酵罐滅菌  

  - 滅菌后需快速建立厭氧環(huán)境：通入氮?dú)庵脫Q罐內(nèi)空氣（3次以上），使氧氣含量＜0.1%（通過(guò)氧化還原電位計(jì)監(jiān)測(cè)）；  

  - 接種時(shí)采用“氮?dú)獗Ｗo(hù)接種法”，通過(guò)無(wú)菌管路將菌種壓入罐內(nèi)，避免接觸空氣。  

3. 連續(xù)滅菌（連消）系統(tǒng)  

  - 需同步滅菌連消塔、維持罐與換熱器，確保各段溫度達(dá)標(biāo)（如連消塔出口溫度135℃，維持罐停留時(shí)間5分鐘）；  

  - 滅菌結(jié)束后，用無(wú)菌水沖洗管路，防止培養(yǎng)基殘留滋生嗜熱菌（如嗜熱脂肪芽孢桿菌）。 

滅菌失敗的常見(jiàn)原因與應(yīng)對(duì)

（一）

問(wèn)題類型：雜菌污染

可能原因：排氣不徹-底、濾膜破損、滅菌時(shí)間不足

解決措施：重新滅菌，檢查濾器完整性，延長(zhǎng)保溫時(shí)間

（二）

問(wèn)題類型：培養(yǎng)基碳化

可能原因：蒸汽通入過(guò)快、底部積料

解決措施：控制升溫速率，滅菌前攪拌均勻物料

（三）

問(wèn)題類型：設(shè)備腐蝕/變形

可能原因：高溫下密封件老化、驟冷驟熱

解決措施：定期更換密封件，采用梯度冷卻

（四）

問(wèn)題類型：傳感器失靈

可能原因：滅菌時(shí)未拆卸或保護(hù)不當(dāng)

解決措施：滅菌前移除精密傳感器，使用耐高溫替代探頭

發(fā)酵罐滅菌需遵循“徹-底性、安全性、經(jīng)濟(jì)性”原則，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP）與實(shí)時(shí)監(jiān)控（如溫度曲線記錄），將滅菌成功率提升至99%以上，為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程奠定基礎(chǔ)。