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發(fā)酵罐滅菌過(guò)程中需要注意哪些事項(xiàng)?

來(lái)源:霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展(廣州)有限公司   2025年06月14日 09:02  

發(fā)酵罐滅菌是確保純種培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),操作不當(dāng)可能導(dǎo)致雜菌污染、設(shè)備損壞或培養(yǎng)基成分破壞。以下是滅菌過(guò)程中需重點(diǎn)注意的事項(xiàng),按滅菌前準(zhǔn)備、滅菌中操作、滅菌后處理三個(gè)階段展開(kāi)說(shuō)明:

一、滅菌前準(zhǔn)備:確保設(shè)備與物料狀態(tài)達(dá)標(biāo)

1. 檢查設(shè)備完整性  

  - 罐體與管路:  

    - 確認(rèn)罐體無(wú)裂縫、焊縫無(wú)滲漏(可通過(guò)打壓測(cè)試,如通入0.1 MPa壓縮空氣,保壓30分鐘,壓力下降<5%視為合格);  

    - 管路連接牢固,尤其是蒸汽進(jìn)口、排氣口、接種口等關(guān)鍵部位,避免蒸汽泄漏導(dǎo)致滅菌不徹-底或人員燙傷。  

  - 傳感器與閥門(mén):  

    - pH電極、溶氧電極需拆卸或用保護(hù)套隔離(避免高溫?fù)p壞);  

    - 所有閥門(mén)(如進(jìn)料閥、取樣閥)需處于開(kāi)啟狀態(tài)(除排氣閥外),確保蒸汽流通無(wú)-死角,尤其是死角區(qū)域(如攪拌軸與罐體連接處、噴嘴背側(cè))。  

2. 培養(yǎng)基預(yù)處理  

  - 成分兼容性:  

    - 避免熱敏性物質(zhì)(如葡萄糖、維生素)與易分解物質(zhì)(如碳酸鈣、銨鹽)直接混合滅菌,可采用“分消法”:先對(duì)糖液?jiǎn)为?dú)滅菌(110℃、15分鐘),再與其他成分混合;  

    - 高黏度培養(yǎng)基(如含淀粉、蛋白胨)需適當(dāng)稀釋或預(yù)攪拌,防止滅菌時(shí)形成“固液分層”導(dǎo)致局部滅菌不徹-底。  

  - 裝液量控制:  

    - 實(shí)罐滅菌時(shí),培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過(guò)罐體容積的70%(預(yù)留蒸汽上升空間),避免滅菌過(guò)程中液體隨蒸汽噴出堵塞排氣口。  

3. 空氣過(guò)濾系統(tǒng)檢查  

  - 好氧發(fā)酵罐滅菌前需確認(rèn)空氣過(guò)濾器(0.22 μm濾膜)已滅菌或更換(若為一次性濾器),避免滅菌后空氣倒吸時(shí)攜帶雜菌;  

  - 關(guān)閉空氣進(jìn)氣管路閥門(mén),防止滅菌時(shí)蒸汽反沖入空氣壓縮機(jī)。  


二、滅菌中操作:嚴(yán)格控制溫度、壓力與時(shí)間

1. 升溫階段:排除冷空氣  

  - 避免“假壓”現(xiàn)象:  

    - 滅菌初期需全開(kāi)排氣閥,緩慢通入蒸汽,待罐內(nèi)冷空氣完-全排出(排氣口蒸汽呈連續(xù)柱狀、無(wú)白霧)后再關(guān)閉排氣閥,開(kāi)始升壓升溫;  

    - 若未排凈冷空氣,罐內(nèi)實(shí)際溫度會(huì)低于壓力表對(duì)應(yīng)溫度(如0.1 MPa表壓下,含空氣時(shí)實(shí)際溫度可能僅100℃,而非標(biāo)準(zhǔn)的121℃),導(dǎo)致滅菌不徹-底。  

2. 保溫階段:精準(zhǔn)維持滅菌條件  

  - 溫度與壓力匹配:  

    - 濕熱滅菌的標(biāo)準(zhǔn)條件為121℃、0.1 MPa(表壓)維持20~30分鐘(針對(duì)50 L以下罐體),大容積罐體需延長(zhǎng)至60分鐘以上;  

    - 實(shí)時(shí)監(jiān)控罐內(nèi)溫度與壓力,確保二者對(duì)應(yīng)(如0.05 MPa對(duì)應(yīng)108℃,0.15 MPa對(duì)應(yīng)128℃),若壓力波動(dòng)超過(guò)±0.02 MPa,需調(diào)整蒸汽流量。  

  - 攪拌與翻動(dòng):  

    - 滅菌過(guò)程中可低速開(kāi)啟攪拌(10~20 rpm),推動(dòng)培養(yǎng)基流動(dòng),避免底部沉積固體(如黃豆餅粉)因傳熱不均導(dǎo)致滅菌死角;  

    - 但需注意:攪拌軸封若為機(jī)械密封,高溫下可能因潤(rùn)滑油脂揮發(fā)導(dǎo)致泄漏,小型罐可手動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌軸代替。  

3. 避免“培養(yǎng)基焦化”  

  - 滅菌時(shí)若蒸汽通入過(guò)快,可能導(dǎo)致罐體底部局部過(guò)熱,培養(yǎng)基中的糖分與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),形成焦糊物(如葡萄糖焦化后生成5-羥甲基糠醛,抑制菌體生長(zhǎng));  

  - 預(yù)防措施:控制蒸汽流速,保持罐內(nèi)溫度上升速率≤3/分鐘,同時(shí)通過(guò)罐體夾套或盤(pán)管緩慢加熱,而非直接通入蒸汽沖擊底部。  


三、滅菌后處理:防止二次污染與設(shè)備損傷

1. 降壓與冷卻:控制速率防止倒吸  

  - 緩慢降壓:  

    - 滅菌結(jié)束后,先關(guān)閉蒸汽閥門(mén),待罐內(nèi)壓力自然降至0.05 MPa以下,再緩慢開(kāi)啟排氣閥(開(kāi)度≤50%),避免因壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基沸騰噴料;  

    - 好氧發(fā)酵罐需在壓力降至接近零前,提前通入無(wú)菌空氣(經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾),維持罐內(nèi)正壓(0.01~0.03 MPa),防止外界空氣倒吸帶入雜菌。  

  - 冷卻方式選擇:  

    - 優(yōu)先采用夾套或盤(pán)管通水冷卻(水溫≤20℃),避免直接向罐體噴淋冷水(可能導(dǎo)致罐體驟冷變形,尤其玻璃罐易炸裂);  

    - 冷卻過(guò)程中需持續(xù)監(jiān)測(cè)罐內(nèi)壓力,若壓力過(guò)低(接近負(fù)壓),需補(bǔ)充無(wú)菌空氣或氮?dú)狻? 

2. 無(wú)菌操作銜接  

  - 接種與取樣:  

    - 滅菌后所有操作需在火焰保護(hù)下進(jìn)行(如接種時(shí)將接種口置于酒精燈火焰旁,快速打開(kāi)并接入菌種);  

    - 取樣閥需先用75%酒精擦拭,再用火焰灼燒滅菌,取樣后立即關(guān)閉閥門(mén)。  

  - 過(guò)濾器與管路維護(hù):  

    - 空氣過(guò)濾器在滅菌后需檢查完整性(如進(jìn)行氣泡點(diǎn)測(cè)試:將濾膜浸入乙醇,通入空氣,觀察氣泡產(chǎn)生時(shí)的壓力是否≥設(shè)計(jì)值的80%);  

    - 管路若需拆開(kāi)(如連接補(bǔ)料泵),接口處需用滅菌紗布包裹,或重新用酒精棉球擦拭滅菌。  

3. 設(shè)備清洗與保養(yǎng)  

  - 及時(shí)清洗:  

    - 滅菌后若培養(yǎng)基殘留罐壁或攪拌槳,需趁熱用溫水(40~50℃)沖洗(避免冷卻后固形物黏附難以清除),再用氫氧化鈉溶液(1%~2%)浸泡30分鐘,最后用清水沖至中性;  

    - 不銹鋼罐體避免使用鋼絲球擦洗,以防刮傷表面鈍化層,可用尼龍刷或海綿。  

  - 部件檢查:  

    - 檢查密封墊片(如O型圈)是否因高溫老化變形,若有裂紋需及時(shí)更換;  

    - 校準(zhǔn)溫度傳感器、壓力表(每年至少一次),確保下一批次滅菌參數(shù)準(zhǔn)確。  


四、特殊場(chǎng)景注意事項(xiàng)

1. 基因工程菌發(fā)酵罐  

  - 滅菌前需確認(rèn)生物安全閥門(mén)已開(kāi)啟(如帶有雙重密封的排氣閥),滅菌后排氣需經(jīng)高效過(guò)濾器(HEPA)處理,防止工程菌隨蒸汽擴(kuò)散;  

  - 若使用一次性發(fā)酵袋,滅菌方式改為輻照滅菌(如鈷-60照射),避免蒸汽濕熱破壞塑料材質(zhì)。  

2. 厭氧發(fā)酵罐滅菌  

  - 滅菌后需快速建立厭氧環(huán)境:通入氮?dú)庵脫Q罐內(nèi)空氣(3次以上),使氧氣含量<0.1%(通過(guò)氧化還原電位計(jì)監(jiān)測(cè));  

  - 接種時(shí)采用“氮?dú)獗Wo(hù)接種法”,通過(guò)無(wú)菌管路將菌種壓入罐內(nèi),避免接觸空氣。  

3. 連續(xù)滅菌(連消)系統(tǒng)  

  - 需同步滅菌連消塔、維持罐與換熱器,確保各段溫度達(dá)標(biāo)(如連消塔出口溫度135℃,維持罐停留時(shí)間5分鐘);  

  - 滅菌結(jié)束后,用無(wú)菌水沖洗管路,防止培養(yǎng)基殘留滋生嗜熱菌(如嗜熱脂肪芽孢桿菌)。 

 

滅菌失敗的常見(jiàn)原因與應(yīng)對(duì)

問(wèn)題類型:雜菌污染

可能原因排氣不徹-底、濾膜破損、滅菌時(shí)間不足

解決措施重新滅菌,檢查濾器完整性,延長(zhǎng)保溫時(shí)間

問(wèn)題類型培養(yǎng)基碳化

可能原因蒸汽通入過(guò)快、底部積料

解決措施控制升溫速率,滅菌前攪拌均勻物料

問(wèn)題類型設(shè)備腐蝕/變形

可能原因高溫下密封件老化、驟冷驟熱

解決措施定期更換密封件,采用梯度冷卻

問(wèn)題類型傳感器失靈

可能原因滅菌時(shí)未拆卸或保護(hù)不當(dāng)

解決措施滅菌前移除精密傳感器,使用耐高溫替代探頭


發(fā)酵罐滅菌需遵循“徹-底性、安全性、經(jīng)濟(jì)性”原則,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程(SOP)與實(shí)時(shí)監(jiān)控(如溫度曲線記錄),將滅菌成功率提升至99%以上,為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

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