監(jiān)管變革：從回避熒光到擁抱精準(zhǔn)

前些年，細(xì)胞株開(kāi)發(fā)領(lǐng)域?qū)晒饧?xì)胞篩選技術(shù)持謹(jǐn)慎態(tài)度，主要體現(xiàn)在外源DNA/蛋白引入，用于生產(chǎn)治療性蛋白（如抗體）的細(xì)胞株開(kāi)發(fā)中，監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如FDA、EMA）要求最終的生產(chǎn)細(xì)胞株盡可能“干凈”，引入熒光蛋白基因及其伴隨的選擇標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）被視為不必要的外源遺傳物質(zhì)，增加了產(chǎn)品的復(fù)雜性和潛在安全風(fēng)險(xiǎn)（如免疫原性）。這些外源基因必須在最終的生產(chǎn)主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)中被移除或證明不存在，這增加了額外的驗(yàn)證成本、負(fù)擔(dān)和風(fēng)險(xiǎn)。

近兩年熒光標(biāo)記技術(shù)興起的轉(zhuǎn)機(jī)來(lái)自于一項(xiàng)融合人工智能與基因編輯的可將生物藥開(kāi)發(fā)時(shí)間從6個(gè)月縮短至1.5個(gè)月的創(chuàng)新技術(shù)-智能定點(diǎn)整合。在2024年BPI US West會(huì)議上，Pfizer、Genentech、Takeda等紛紛展示了各自的定點(diǎn)整合平臺(tái)：Pfizer采用雙質(zhì)粒雙位點(diǎn)策略，通過(guò)BxB1整合酶將兩個(gè)不同載體分別整合到兩個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)，用紅綠熒光標(biāo)記篩選無(wú)熒光轉(zhuǎn)化子。

Pfizer演講現(xiàn)場(chǎng)（BPI US West展會(huì)）[1]

Genentech則開(kāi)發(fā)了單一位點(diǎn)多質(zhì)粒順序整合技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了一個(gè)knob-into-hole雙抗的11g/L高表達(dá)；AbbVie和MSD的聯(lián)合分析顯示，傳統(tǒng)細(xì)胞株開(kāi)發(fā)平均耗時(shí)24-28周，而定點(diǎn)整合技術(shù)可縮短70%以上時(shí)間。

Genentech演講現(xiàn)場(chǎng)（BPI US West展會(huì)）[1]

國(guó)內(nèi)也有一些定點(diǎn)整合平臺(tái)，如大灣生物AlfaCell平臺(tái)已與鼎康生物CDMO平臺(tái)深度整合，為客戶提供全流程加速服務(wù)；博安生物則在2024年10月推出了BA-Fastcell®平臺(tái)[2]。

技術(shù)革新：智能定點(diǎn)整合的本質(zhì)突破

智能定點(diǎn)整合技術(shù)（Intelligent Site-Specific Integration，SSI）是基因編輯技術(shù)、人工智能算法與自動(dòng)化設(shè)備的融合。與傳統(tǒng)隨機(jī)整合（RTI）相比，它實(shí)現(xiàn)了從“盲目撒網(wǎng)”到“精準(zhǔn)投放”的根本轉(zhuǎn)變。

SSI帶來(lái)的變革主要體現(xiàn)在四個(gè)關(guān)鍵維度：

開(kāi)發(fā)速度飛躍

將傳統(tǒng)24-28周的周期壓縮至6周。大灣生物展示的數(shù)據(jù)顯示，從DNA轉(zhuǎn)染到獲得研究細(xì)胞庫(kù)（RCB）僅需1.5個(gè)月。深圳太力生物的服務(wù)明確承諾1.5個(gè)月內(nèi)交付穩(wěn)定高產(chǎn)單克隆。

產(chǎn)量質(zhì)量雙升

表達(dá)量普遍達(dá)5g/L以上，是傳統(tǒng)方法的1.5-2倍。更值得關(guān)注的是，雙抗正確配對(duì)率突破80%，產(chǎn)品純度可達(dá)98.8%。穩(wěn)定性也顯著提升，達(dá)到100 %穩(wěn)定性傳遞。

成本大幅降低

僅用“1塊96孔板”即可完成單克隆篩選，避免大量重復(fù)工作。Pfizer等企業(yè)的實(shí)踐表明，定點(diǎn)整合技術(shù)可減少30%以上的開(kāi)發(fā)成本。

監(jiān)管路徑優(yōu)化

均一性高的細(xì)胞池獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可，成為IND時(shí)間線突破的新窗口。在BPI Asia 2024會(huì)議上，專家指出定點(diǎn)整合細(xì)胞株的數(shù)據(jù)一致性顯著簡(jiǎn)化了審批流程。

SSI核心技術(shù)采用兩步走策略：

第1步：熒光宿主細(xì)胞構(gòu)建與篩選

利用CRISPR-Cas9等基因編輯工具，在CHO細(xì)胞基因組中篩選高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，插入包含熒光蛋白（如GFP）及重組酶識(shí)別位點(diǎn)（如BxB1 attP位點(diǎn)）作為“著陸墊”（landing pad）。此階段需篩選獲得熒光均一、生長(zhǎng)穩(wěn)健的單克隆宿主細(xì)胞。

第2步：目的基因精準(zhǔn)整合與篩選

將包含目標(biāo)基因（如抗體序列）和同源重組臂的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，利用重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組，將目標(biāo)基因精準(zhǔn)置換熒光標(biāo)記。成功整合的細(xì)胞會(huì)失去熒光信號(hào)，成為“無(wú)熒光轉(zhuǎn)化子”。此階段需篩選出成功整合的無(wú)熒光的陽(yáng)性克隆。

Cytena單細(xì)胞打印機(jī)在智能定點(diǎn)整合技術(shù)中的應(yīng)用

宿主細(xì)胞篩選階段

基于熒光強(qiáng)度高效分選陽(yáng)性宿主細(xì)胞，溫和的噴墨技術(shù)確保細(xì)胞活力。

目的基因整合后細(xì)胞篩選階段

目的基因整合后細(xì)胞篩選階段：在一群熒光細(xì)胞中反向精準(zhǔn)分選無(wú)熒光細(xì)胞（即成功整合的細(xì)胞），其噴嘴圖像可提供單細(xì)胞來(lái)源的證據(jù)，單細(xì)胞率>95%。

Cytena設(shè)備的優(yōu)勢(shì)在于：分選溫和、快速、單細(xì)胞率高，熒光和非熒光細(xì)胞都能高效分選、使用無(wú)菌一次性墨盒杜絕交叉污染、結(jié)合成像設(shè)備可提供完整的克隆生長(zhǎng)追蹤報(bào)告，滿足FDA單克隆源性要求。

智能定點(diǎn)整合單克隆篩選流程圖

站在生物制藥工業(yè)化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)上，智能定點(diǎn)整合技術(shù)代表的不僅是效率提升，更是一種研發(fā)范式的根本轉(zhuǎn)變——從隨機(jī)試錯(cuò)走向理性設(shè)計(jì)，從人工操作邁向智能自動(dòng)化。

然而，一個(gè)不可忽視的現(xiàn)實(shí)是：市場(chǎng)上定制一個(gè)采用智能定點(diǎn)整合技術(shù)開(kāi)發(fā)的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞株，價(jià)格往往高達(dá)上千萬(wàn)人民幣。這對(duì)于許多研發(fā)管線豐富、項(xiàng)目迭代快的生物技術(shù)公司，尤其是處于發(fā)展關(guān)鍵期的Biotech而言，無(wú)疑是一筆沉重的負(fù)擔(dān)，讓不少企業(yè)望而卻步。這高昂的“入場(chǎng)券”，反而點(diǎn)燃了另一股燎原之火——越來(lái)越多的企業(yè)不再滿足于“購(gòu)買服務(wù)”，而是開(kāi)始戰(zhàn)略性“投資未來(lái)”，著手自主組建智能定點(diǎn)整合技術(shù)平臺(tái)！

自主平臺(tái)的構(gòu)建離不開(kāi)關(guān)鍵設(shè)備的投入，Cytena單細(xì)胞打印機(jī)是平臺(tái)的核心硬件，貫穿宿主細(xì)胞篩選和目的基因整合細(xì)胞篩選兩大關(guān)鍵步驟，確保高效率、高活力、合規(guī)的單克隆分離。

參考資料：

【1】筆者親歷丨定點(diǎn)整合殺瘋了的BPI US West現(xiàn)場(chǎng)

【2】博安生物定點(diǎn)整合細(xì)胞株開(kāi)發(fā)平臺(tái)BA-Fastcell®亮相BPI Asia 2024