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ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范:從樣本處理到結(jié)果判讀全流程詳解

來(lái)源:天津天正信達(dá)生物科技有限公司   2025年07月04日 14:08  

  

  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))是一種高靈敏、高特異的免疫檢測(cè)技術(shù),廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物研究和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。ELISA試劑盒通常包含預(yù)包被板、檢測(cè)抗體、酶標(biāo)記物、底物、終止液等組分,其測(cè)定方法主要包括直接法、間接法、夾心法(雙抗體夾心)和競(jìng)爭(zhēng)法。

  1. ELISA試劑盒的常見(jiàn)測(cè)定方法

  (1) 雙抗體夾心法(Sandwich ELISA)

  適用對(duì)象:大分子抗原(如蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、病毒顆粒)

  原理:

  包被抗體:微孔板預(yù)包被捕獲抗體(Capture Antibody)。

  加樣本:待測(cè)抗原與捕獲抗體結(jié)合。

  加檢測(cè)抗體:酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體(Detection Antibody)與抗原另一表位結(jié)合。

  顯色:加入底物(如TMB),酶催化顯色,OD值測(cè)定。

  特點(diǎn):

  高靈敏度(可檢測(cè)pg/mL級(jí))。

  需抗原至少有兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)(不適用于小分子)。

  (2) 間接法(Indirect ELISA)

  適用對(duì)象:抗體檢測(cè)(如血清抗體、疫苗效價(jià)評(píng)估)

  原理:

  包被抗原:微孔板包被已知抗原。

  加樣本:待測(cè)抗體(如血清)與抗原結(jié)合。

  加二抗:酶標(biāo)記的二抗(如HRP-抗人IgG)與一抗結(jié)合。

  顯色:加入底物,測(cè)定OD值。

  特點(diǎn):

  適用于多種抗體檢測(cè)(只需更換包被抗原)。

  信號(hào)放大效果強(qiáng)(因二抗可結(jié)合多個(gè)酶分子)。

  (3) 競(jìng)爭(zhēng)法(Competitive ELISA)

  適用對(duì)象:小分子抗原(如激素、藥物、毒素)

  原理:

  包被抗原/抗體:微孔板包被抗原或抗體。

  加樣本+酶標(biāo)抗原:待測(cè)樣本與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。

  顯色:樣本中抗原越多,酶標(biāo)抗原結(jié)合越少,信號(hào)越低(負(fù)相關(guān))。

  特點(diǎn):

  適用于半抗原(如農(nóng)藥殘留)。

  結(jié)果需反向解讀(OD值越低,樣本濃度越高)。

  (4) 直接法(Direct ELISA)

  適用對(duì)象:快速檢測(cè)(如病毒抗原篩查)

  原理:

  包被抗體:微孔板包被捕獲抗體。

  加樣本:待測(cè)抗原結(jié)合。

  加酶標(biāo)抗體:直接使用酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體(無(wú)二抗步驟)。

  顯色:測(cè)定OD值。

  特點(diǎn):

  步驟簡(jiǎn)單,但靈敏度較低。

  適用于高濃度抗原檢測(cè)。

  2. ELISA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵要求

  (1) 樣本處理要求

  血清/血漿:避免溶血(血紅蛋白會(huì)干擾顯色),離心后取上清。

  細(xì)胞培養(yǎng)上清:去除細(xì)胞碎片(離心10,000 ×g,5分鐘)。

  組織勻漿:需裂解、離心,取澄清上清。

  保存條件:短期4°C,長(zhǎng)期-80°C(避免反復(fù)凍融)。

  (2) 試劑準(zhǔn)備要求

  平衡至室溫:所有試劑使用前需平衡(避免冷凝水影響濃度)。

  避免污染:不同試劑使用專用槍頭。

  稀釋比例:嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作(如1:100稀釋血清)。

  (3) 反應(yīng)條件控制

  孵育時(shí)間:37°C 1小時(shí)或4°C過(guò)夜(延長(zhǎng)孵育可提高靈敏度)。

  洗滌次數(shù):通常3-5次(殘留洗滌液會(huì)導(dǎo)致高背景)。

  顯色時(shí)間:TMB顯色10-30分鐘(過(guò)長(zhǎng)會(huì)飽和)。

  (4) 儀器要求

  酶標(biāo)儀:選擇適配波長(zhǎng)(如TMB→450 nm,OPD→492 nm)。

  移液器校準(zhǔn):確保加樣精度(誤差<5%)。

  3. 常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

  問(wèn)題可能原因解決方案

  信號(hào)弱/無(wú)信號(hào)抗體失效、孵育時(shí)間不足更換抗體,延長(zhǎng)孵育時(shí)間

  背景高封閉不充分、洗滌不增加封閉劑濃度,加強(qiáng)洗滌(如5次)

  孔間差異大加樣不均、氣泡干擾使用多通道移液器,離心去除氣泡

  標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差稀釋錯(cuò)誤、酶標(biāo)板邊緣效應(yīng)重新稀釋樣本,避免使用邊緣孔

  4. 結(jié)果分析與數(shù)據(jù)解讀

  標(biāo)準(zhǔn)曲線:用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品繪制(通常4-5參數(shù)擬合)。

  計(jì)算濃度:根據(jù)樣本OD值代入曲線方程。

  質(zhì)量控制:

  空白孔(Blank):僅加緩沖液,OD應(yīng)接近0。

  陰性對(duì)照(NC):應(yīng)低于Cut-off值。

  陽(yáng)性對(duì)照(PC):應(yīng)在預(yù)期范圍內(nèi)。

  5. 總結(jié)

  選擇合適方法:大分子用夾心法,小分子用競(jìng)爭(zhēng)法,抗體檢測(cè)用間接法。

  嚴(yán)格操作流程:控制孵育時(shí)間、溫度、洗滌次數(shù)。

  數(shù)據(jù)驗(yàn)證:每次實(shí)驗(yàn)需包含標(biāo)準(zhǔn)曲線和對(duì)照。

  注:以上資料僅供參考,不作為實(shí)驗(yàn)依據(jù),如需完整版產(chǎn)品信息請(qǐng)咨詢品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。

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