【參數(shù)信息】
英文名稱:GT115 Electrocompetent Cell
中文名稱:GT115 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
運(yùn)輸條件:干冰運(yùn)輸。
穩(wěn)定性關(guān)鍵因素:
反復(fù)凍融會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率;
高于-80℃會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
純度:≥95%
儲(chǔ)存條件:-20℃避光干燥
生產(chǎn)廠商:西安強(qiáng)化生物科技
【簡(jiǎn)單概述】
GT115 Electrocompetent Cell是一種通過電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)外源DNA高效轉(zhuǎn)化的大腸桿菌工程菌株。
用于克隆含發(fā)夾結(jié)構(gòu)或重復(fù)序列等復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA片段。
其核心特性包括:
基因型特殊性
基因型:F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15ΔlacX74 recA1 rpsL (StrR) endA1 Δdcm uidA(ΔMluI)::pir-116 ΔsbcC-sbcD 。
關(guān)鍵突變:
ΔsbcC-sbcD:消除SbcCD蛋白復(fù)合體活性,防止其識(shí)別并切割DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu),提升發(fā)夾結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的穩(wěn)定性與拷貝數(shù) 。
uidA(ΔMluI)::pir-116:表達(dá)π蛋白(Pi protein),支持含R6Kγ復(fù)制原點(diǎn)的質(zhì)粒的復(fù)制 。
recA1和endA1突變:抑制重組酶和核酸酶活性,減少外源DNA降解,提高質(zhì)粒純度 。
rpsL (StrR):賦予鏈霉su抗性,便于轉(zhuǎn)化篩選 。
電轉(zhuǎn)特性
通過高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)孔隙,使DNA直接進(jìn)入胞內(nèi),轉(zhuǎn)化效率高達(dá) >1×101? cfu/μg DNA,遠(yuǎn)超化學(xué)法 。
適用于文庫構(gòu)建、大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及低濃度DNA樣品 。
【使用方法】
(1)將0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min,待其瀝干水分,正置5min,使乙醇充分揮發(fā)干凈,立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5min使其充分降溫。
(2)取-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min,待其融化。
(3)往50μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA,用手撥管底使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。
(4)用槍輕輕吹打混勻感受態(tài)細(xì)胞-DNA之后快速轉(zhuǎn)移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,輕輕晃動(dòng)使液面保持水平,蓋上杯蓋,插入冰中。
(5)啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV,將電擊杯從冰內(nèi)取出,用吸水紙擦干表面水漬,放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成后取出電擊杯放室溫。
打開杯蓋,15s內(nèi)加入900μl無抗生素的無菌S.O.C.培養(yǎng)基,用1ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50ml離心管,向離心管內(nèi)補(bǔ)加預(yù)熱的S.O.C.培養(yǎng)基定容至10ml。
于37℃,225rpm振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)1h。
(6)5,000rpm離心1min,重懸后取100~200μl加到含相應(yīng)抗生素的S.O.C.平板上,用無菌玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。
室溫正置10 min,待液體被吸收后,倒置平板,37℃過夜培養(yǎng)13~17h。
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